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如何拯救你 那些被污染的細(xì)胞

  污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵,。預(yù)防和避免污染是細(xì)胞培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一,。一開始就要十分重視，防止污染,，否則會(huì)前功盡棄,，不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且浪費(fèi)人力、物力,，甚造成無法彌補(bǔ)的損失,。

　　(一)污染的類型

　　細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染不僅僅指微生物，而且還包括所有混入培養(yǎng)環(huán)境中的,、對(duì)細(xì)胞生存有害或造成細(xì)胞不純的物質(zhì),，包括生物和化學(xué)物質(zhì)。

　　1,、細(xì)菌污染

　　細(xì)菌污染是實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染,，即使在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素，也可能因?yàn)椴僮鞑簧鞫鹞廴?。常見的有革蘭氏陽性菌,，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌,，其中又以白色葡萄球菌較常見,。

　　培養(yǎng)細(xì)胞受細(xì)菌污染后，會(huì)出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁,，pH改變,。污染后細(xì)胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多,、增粗,，后變圓脫落死亡。

　　2,、真菌污染

　　真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中常見的一種,，常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌,、孔子霉,、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌,。

　　培養(yǎng)細(xì)胞受真菌污染后,，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點(diǎn)，有的散在生長,，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁;倒置顯微鏡下可見絲狀,、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯(cuò)在細(xì)胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列,。

　　真菌污染后,，細(xì)胞生長變慢，但后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡,。

絲狀菌污染

　　3,、支原體污染

　　支原體是介于細(xì)菌與病毒之間能獨(dú)立生活的小微生物，小直徑0.2μm，一般過濾除菌無法去除它,，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu),。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件下生存,，對(duì)青霉素有抗藥性,。多吸附于細(xì)胞表面或散在于細(xì)胞之間。

　　培養(yǎng)細(xì)胞受支原體污染后,，部分敏感細(xì)胞可見細(xì)胞生長增殖變慢,，部分細(xì)胞變圓，從瓶壁脫落,。但多數(shù)細(xì)胞污染后無明顯變化,，或略有變化,，若不及時(shí)處理,，還會(huì)產(chǎn)生交叉污染。

陽性

陰性

　　4,、病毒污染

　　組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，如果沒有除去潛在的病毒，就會(huì)產(chǎn)生病毒污染,。目前,，從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。

　　盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng),，但生產(chǎn)疫苗是不安全的,。因此，潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗,、干擾素等生物制品制作中的難題,。

　　5、非同種細(xì)胞污染

　　由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,，往往會(huì)使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染,。目前，世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,，致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效,。

　　非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致,。

　　(二)污染的鑒別

　　1,、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)

　　(1)肉眼觀察

　　細(xì)菌,、真菌污染常在傳代,、換液、加樣等開放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速,，若有污染,，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到，例如培養(yǎng)液變混濁,，或略加振蕩有很多漂浮物漂起,。

　　(2)接種觀察

　　采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染,。

　　(3)鏡下觀察

　　在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮,，即為細(xì)菌污染。

　　若細(xì)胞之間有絲狀,、管狀,、樹枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

　　2,、支原體污染的檢測(cè)

　　(1)相差顯微鏡觀察

　　直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上,，再蓋上蓋片觀察，支原體在鏡下呈暗色微小顆粒,，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間,，有時(shí)可見類似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別,。

　　(2)熒光染色法觀察

　　用熒光染料Hoechst33258,，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色,，熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn),，散在于細(xì)胞周圍或附于細(xì)胞表面。

　　(3)電鏡檢測(cè)

　　若條件許可,，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察,。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前,，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行固定,、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察,。

支原體掃描電鏡圖片

　　(4)培養(yǎng)檢測(cè)

　　將細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基,，培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中,，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng),，37℃培養(yǎng)3天觀察有無“荷包蛋"菌落出現(xiàn)。

　　3 ,、病毒的檢測(cè)

　　1) 應(yīng)用電鏡技術(shù)快速診斷動(dòng)物病毒病

冠狀病毒電鏡圖

　　2) 逆轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)RT_PCR檢測(cè)病毒

　　(三)污染的清除

　　培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,，多數(shù)較難處理,。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大，宜棄之;在尋找原因后*消毒操作室,，復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,，再培養(yǎng)。

　　若污染細(xì)胞價(jià)值較大,，又難于重新得到,，可采取以下辦法清除。

　　一,、細(xì)菌和真菌的清除

　　1,、使用抗生素

　　抗生素對(duì)殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好,。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好,。預(yù)防用藥一般用雙抗生素，污染后清除用藥需采用大于常用量5～10倍的沖洗法,，于加藥后作用24～48小時(shí),，再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期有效,。

　　二,、支原體的清除

　　1,、用MRA處理

　　用MRA(Mycoplasma Removal Agent)處理細(xì)胞,，每4天換一次液,連續(xù)處理15天以確保細(xì)胞純潔健康，效果好.

　　2,、用清洗純化法清除支原體污染的方法

　　細(xì)胞營養(yǎng)馴化→細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌

　　其原理是利用離心力,、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的,。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低限,。

　　如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用,，可達(dá)到更好的效果。

　　3,、藥物輔助加溫處理

　　先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí),，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響,。

　　4、使用支原體特異性血清

　　用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染,，因特異抗體可抑制支原體生長,，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,，并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩,，不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì),。

　　(四)、污染的預(yù)防

　　預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的好辦法,。只有預(yù)防工作做在前,，才能將發(fā)生污染的可能性降到小程度。

　　一般預(yù)防可從以下幾方面著手：

　　1,、添加抗生素

　　2,、從物品,、用品消毒滅菌著手

　　細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗,、消毒要*，各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),，并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。

　　操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌,。

　　3、從操作者做起

　　(1)進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手,，按規(guī)定穿隔離衣。工作開始要先用75%酒精棉球擦手,、擦瓶口和燒灼瓶口,。

　　(2)操作者動(dòng)作要輕，必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,，并將瓶口轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼。操作時(shí)盡量不要談話,，若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。

　　(3)操作時(shí)要常更換吸管,，一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢用消毒水浸泡的紗布擦臺(tái)面,。

　　4、防止細(xì)胞交叉污染

　　在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分。

　　在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),，注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞,。

　　細(xì)胞一旦購置或從別處引入，均應(yīng)及早留種凍存,，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇培養(yǎng)。

　　5,、無菌室的*消毒

　　1) 0.1%新潔爾滅全面*擦洗無菌室;

　　2)甲醛熏蒸法：甲醛是一種廣譜滅菌劑菌,，其水溶液和氣休對(duì)各種細(xì)菌,、芽孢及真菌等微生物均有殺滅作用,。