關(guān)鍵詞:原核表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡(jiǎn)介：世界*品牌原核表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
原核表達(dá)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系,。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧,，承諾客戶(hù)不成功不收費(fèi),。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶(hù)可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.,。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)方案 
1.  外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)
（1 ）用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
（2 ）按連接步驟連接目的基因和載體,，并轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的宿主菌,。
（3 ）篩選出含重組子的轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒DNA 作限制性?xún)?nèi)切核酸酶圖譜,，DNA 序列測(cè)定,，確定無(wú)誤后進(jìn)行下一步。
（4 ）如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為PL 啟動(dòng)子,，則在30 -32 ℃ 培養(yǎng)數(shù)小時(shí),，使培養(yǎng)液的OD600達(dá)0.4-0.6 ,，迅速使溫度升至42 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h ；如果表達(dá)載體的原核啟動(dòng)子為tac 等,，則37 ℃培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)小時(shí)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后加IPTG 至終濃度為1 mmol / L,。繼續(xù)培養(yǎng)3 -5 h 。
(5 ）取上述培養(yǎng)液1 ml,，1 000 g 離心,，1 min，沉淀,，加100 μL 聚丙烯酰胺凝膠電泳上樣緩沖液后,，作SDS -PAGE 檢測(cè)。
2.  大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化
（1 ）細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法,；② 高壓勻漿,；③ 超聲破碎法；④ 酶溶法,；⑤ 化學(xué)滲透等,。前三種方法屬機(jī)械破碎法，并且方法① ,、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,，后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟,。
a.  酶溶法,。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶,；β-1,6 -葡聚糖酶,；蛋白酶；殼多糖酶,；糖昔酶等,。溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類(lèi)有作用，而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著,。
主要步驟為：
① 4 ℃ ,，5 000 rpm 離心，15 min ,，收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液（100 ml ）,。棄上清，約每克濕菌加3 ml 裂解緩沖液,，懸浮沉淀,。
② 每克菌加8 μL PMSF 及80μL 溶菌酶，攪拌20 min ,；邊攪拌邊每克菌加4 mg 脫氧膽酸（在冷室中進(jìn)行）,。
③ 37 ℃ ,，玻棒攪拌，溶液變得粘稠時(shí)加每克菌20μL DNase I,。室溫放置至溶液不再粘稠,。
b.  超聲破碎法。聲頻為15-20 kHz 的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎,，在處理少量樣品時(shí)操作簡(jiǎn)便,，液體量損失較少，同時(shí)還可對(duì)染色體DNA 進(jìn)行剪切,，大大降低液體的粘稠度,。
① 收集1 L 誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，40 ℃ ,，5 000 rpm 離心,，15 min ；棄上清,，約每克濕菌加3 mlTE 緩沖液,。
② 按超聲處理儀廠(chǎng)家提供的功能參數(shù)進(jìn)行破菌；10 000 g 離心,，15 min ,，分別收集上清液和沉淀。
③ 分別取少量上清和沉淀,，加入等體積的2× 凝膠電泳加樣緩沖液,，進(jìn)行SDS -PAGE 。
注意事項(xiàng)：超聲破碎與聲頻,、聲能,、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度,、菌種類(lèi)型等因素有關(guān),，應(yīng)根據(jù)具體情況掌握；超聲波破菌前,，標(biāo)本經(jīng)3 -4 次凍溶后更容易破碎。