關(guān)鍵詞:細(xì)胞永生化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
簡介：世界*品牌細(xì)胞永生化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)原裝,，質(zhì)量保證,*,。
細(xì)胞永生化技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi),。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信,，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒,，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。,。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測序?qū)嶒?yàn)流程：
實(shí)驗(yàn)步驟：
1.  EB病毒液的制備
?  復(fù)蘇B95.8細(xì)胞株,，使用培養(yǎng)基為10% FCS RPMI-1640
?  逐步添加培養(yǎng)基至細(xì)胞長至對數(shù)生長期
?  細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量為1×10^6個(gè)/ml
?  在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)續(xù)培養(yǎng)10天,，中間不換液
?  至第10天收集培養(yǎng)上清,，1800rpm,，4℃離心15分鐘
?  0.22μm濾器過濾，1ml/支分裝,，凍存于液氮備用
2.  病人外周血液的采集,、分離
①  取病人外周血4ml+4mlBSS，混勻
②  各取4ml緩慢加入含有3ml淋巴細(xì)胞分離液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences貨號:71716700,使用前,，充分混勻）的10ml離心管中（分兩管進(jìn)行）
③  400g，18℃，離心30min
④  小心吸取上層血漿，保存?zhèn)溆?，避免擾動細(xì)胞。
⑤  小心吸取淋巴細(xì)胞層至新的15ml離心管中
⑥  加入6mlBSS,，以吸管輕輕重懸細(xì)胞
⑦  100g,，18℃,，離心10min,，棄上清
⑧  以8mlBSS再次洗滌一遍,，離心，棄上清（重懸同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)）
(一般1ml血能分離出1×10^6個(gè)細(xì)胞,，故4ml血約有4×10^6個(gè)細(xì)胞)
3.  EB病毒轉(zhuǎn)化淋巴細(xì)胞
①  取EBV上清1ml重懸上述細(xì)胞,，37℃水浴,，2h,，20min晃動一次
②  加入3ml 20％FBS-1640全培,，含0.2 μg/ml cyclosporin A （環(huán)孢素A Sigma Product No. C1832 ）
③  分兩孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分離的血量大,，請酌情考慮加入25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)）,，37℃,，5％CO2培養(yǎng)
④  一般24h后即可見到細(xì)胞聚集成團(tuán)生長,，3-5天可見液體PH值發(fā)生變化,，呈橙黃色，早期視情況補(bǔ)液,，待細(xì)胞生長良好再采用半量換液（培養(yǎng)基為 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）
⑤  一般15天左右即可建立穩(wěn)定生長的淋巴母細(xì)胞。
經(jīng)驗(yàn)總結(jié)及注意事項(xiàng)：
環(huán)孢素A容易吸附在容器上,，請配成高濃度貯液,，工作液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。
EB病毒液請按照上述方法制備，保證高的病毒滴度,，不可4℃存放！??！
外周血盡量新鮮采集,，并保證無菌,，推薦使用枸櫞酸鈉抗凝管?。?！
進(jìn)行EB病毒感染永生化的細(xì)胞不要少于1×10^6,，少于該數(shù)會影響成功率。