流動(dòng)相(MOBLLE PHASE)的問題
甲醇和乙腈在高效液相色譜分析法中常常被用來配制流動(dòng)相,。高效液相色譜法中常用的試劑最好是高等級(jí)的專用試劑,，如色譜純?cè)噭Ｔ谝蟛惶珖?yán)格時(shí),，優(yōu)級(jí)純甚至分析純的試劑也能用,。高效液相色譜分析法中常用的是紫外檢測(cè)器，因此,，從降低基線噪音和提高分析靈敏度上來考慮,，應(yīng)該使用紫外吸收小且雜質(zhì)含量少的色譜純?cè)噭?/span>
1、流動(dòng)相的過濾
配制好的流動(dòng)相在使用前一定要先用0.5um孔徑的微孔濾膜來過濾,。這是因?yàn)槿芤褐泻泻芏嗳庋垭y以發(fā)現(xiàn)的微小顆粒,，如果不把它們?yōu)V除掉，就會(huì)堵塞泵口,、柱頭上的過濾器,，這樣就堵塞了流動(dòng)相的正常通道，使色譜柱的阻力增加,，柱壓升高,，柱效下降。碰到這種情況時(shí),，要換用經(jīng)過濾的流動(dòng)相,，并將堵塞的濾器拆下來浸泡在20%的硝酸水溶液中以超聲波清洗機(jī)清洗20分鐘，以除去濾片上的堵塞物,。
2,、流動(dòng)相的脫氣
流動(dòng)相在使用前必須脫氣，以盡可能的除去溶解在流動(dòng)相中的氣體,，否則,，這些氣體會(huì)使柱填料的性能降低，還能夠?qū)z測(cè)器的信號(hào)產(chǎn)生很大的干擾,。脫氣有多種方法,，如超聲脫氣、真空脫氣,、氮?dú)饷摎獾?。真空脫氣法和氮?dú)饬髅摎夥ㄊ悄壳?/span>的脫氣法。水和甲醇混合后會(huì)產(chǎn)生大量的氣泡,，如果不脫氣就使用,，氣泡就會(huì)進(jìn)入色譜柱和檢測(cè)器,，并將影響分析工作的正常進(jìn)行。
色譜柱的使用
色譜柱是高效液相色譜儀最主要的部件,，被測(cè)物質(zhì)能否被很好的分離和測(cè)定,，色譜柱的性能起著決定性的作用。因此,，在日常工作中,，應(yīng)特別注意色譜柱的正確使用和維修保養(yǎng)，以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命,。
1,、使用預(yù)柱和保護(hù)柱
預(yù)柱(pre-column)安裝于泵和進(jìn)樣器之間，它給色譜柱中的流動(dòng)相提供了*的平衡,，并防止了對(duì)柱填料有破壞作用的組分或污染物進(jìn)入色譜柱,。保護(hù)柱(guard column)可以阻擋能夠牢固地吸附于色譜柱上的組分進(jìn)入色譜柱，保護(hù)柱應(yīng)與色譜柱的填料相同,。預(yù)柱和保護(hù)柱可以經(jīng)常更換,，而不需要經(jīng)常更換色譜柱，這就延長(zhǎng)了色譜柱的使用壽命,。
2,、防止氣體進(jìn)入色譜柱
有些色譜柱(如凝膠柱)是不允許氣泡進(jìn)入的，否則將會(huì)使柱效降低甚至形成微小的難以驅(qū)除的氣室,。因此,，為了防止氣泡進(jìn)入色譜柱，一定要使用經(jīng)過脫氣的流動(dòng)相,，并且要嚴(yán)格按照下列步驟來安裝色譜柱：
a.拆卸下色譜柱入口處的密封螺絲,，觀察是否有溶劑滲出；
b.如有溶劑滲出,，即可將色譜柱接到管路上,，以避免氣泡的進(jìn)入；
c.如無溶劑滲出時(shí),，表明色譜柱的此端已經(jīng)進(jìn)去空氣了,，此時(shí)，可將色譜柱的出口端接到進(jìn)樣閥上,，以流動(dòng)相來反方向沖洗色譜柱,，以便將柱內(nèi)的空氣排除。最好以0.2ml/min的小流量來沖色譜柱,，如果溶劑的流速太快或者是壓力突然的上升都將會(huì)導(dǎo)致柱性能的降低,；
d.如果流出的溶劑里不含有氣泡，說明柱內(nèi)的氣體已經(jīng)被排出了,，再將色譜柱以正確的方向接好,，這樣氣泡就進(jìn)不到色譜柱里面了,。
3、色譜柱的清洗
為了不使被測(cè)物質(zhì)和雜質(zhì)停留在色譜柱中,，在每次的樣品分析工作完成之后,，都應(yīng)及時(shí)地清洗色譜柱。首先要用對(duì)被測(cè)樣品洗脫能力強(qiáng)的溶劑來洗脫色譜柱,，以分析工作中常用的反相色譜分析法為例,，因其先流出的物質(zhì)是極性大的物質(zhì)，此時(shí)應(yīng)用100%的甲醇或使用異丙純,、四氫呋喃等極性稍弱的溶劑將吸附在柱內(nèi)的極性小的物質(zhì)洗脫下來，洗脫液的用量一般為柱體積的20倍即可,。如果流動(dòng)相是緩沖溶液,，則應(yīng)先用蒸餾水來沖洗色譜柱，以沖掉柱內(nèi)的鹽,，然后再用合適的溶劑來沖洗,。
凝膠濾過色譜法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝膠柱常用緩沖溶液做流動(dòng)相，用完之后當(dāng)然要用蒸餾水來沖洗,。如果是連續(xù)操作,，可以將緩沖溶液置于柱內(nèi)過夜，但最好是維持小流速(＜0.5ml/min)以防止緩沖鹽的析出,，如果流動(dòng)相中含有鹵化物,，即使是停一夜，也必須要用蒸餾水將色譜柱沖洗干凈,，以防止它們對(duì)柱體的腐蝕,。
