紫外分光光度法測蛋白酶酶活力

美析儀器有限公司

關(guān)鍵詞：紫外分光光度法,；蛋白酶；美析儀器；UV-1700紫外分光光度計

1、原理 

蛋白酶在一定的溫度與pH條件下,，水解酪素底物，然后加入三lu.yi.suan終止酶反應(yīng),，并使未水解的酪素沉淀除去,，濾液對紫外光有吸收，可用紫外分光光度法測定,。根據(jù)吸光度計算其酶活力,。酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在一定溫度和pH值條件下,，1min水解酪素產(chǎn)生1ug酪氨酸為一個酶活力單位,，以（u/mL）表示,。

2,、試劑和溶液 

2.1  三lu.yi.suanc（CCL3·COOH）=0.4mol/L 稱取三lu.yi.suan65.4g，用水溶解并定容至1000 mL,。

2.2  氫氧化鈉溶液c（NaOH）=0.5mol/L 按GB601配制,。 

2.3  鹽酸溶液c（HCL）＝1 mol/L及0.1 mol/L 

1 mol/L HＣＬ:取90mL濃鹽酸溶解于去離子水中，定容至1000mL,。 0.1 mol/L HＣＬ：取9mL濃鹽酸溶解于去離子水中,，定容至1000mL。 

2.4  緩沖溶液 

a,、磷酸緩沖液（pH＝7.5）適用于中性蛋白酶 

稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）0.5g,，加水溶解并定容至1000mL。 

b,、乳酸緩沖液（pH＝3.0）適用于酸性蛋白酶 

甲液  稱取乳酸（80％～90％）10.6g,，加水溶解并定容至1000 mL,。 乙液  稱取乳酸鈉（70％）16g，加水溶解并定容至1000 mL,。 

使用溶液  取甲液8 mL,，加乙液1 mL，混勻,，稀釋一倍,，即成0.05moi/L乳酸緩沖溶液。 

c,、硼酸緩沖溶液（pH＝10.5）適用于堿性蛋白酶 

甲液  稱取硼酸鈉（硼砂）19.08g,，加水溶解并定容至1000 mL。 乙液  稱取氫氧化鈉4.0g,，加水溶解并定容至1000 mL,。 

使用溶液  取甲液500 mL、乙液400 mL混勻,，用水稀釋至1000mL,。 上述各種緩沖溶液，均須用pH計校正,。 

2.5  10g/L酪素溶液稱取酪素1.000g,，至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸2～3滴）濕潤后,，加入適量的各種適宜pH的緩沖溶液約80 mL,，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到*溶解,，冷卻后,，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的ｐH緩沖溶液稀釋至刻度,。此溶液在冰箱內(nèi)貯存,，有效期為三天。 

2.6 100ug/mL L－酪氨酸標準溶液 

a,、稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g,，至0.0002g，用1mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL,，即為1mg/mL酪氨酸標準溶液,。 

b、吸取1mg/ mL酪氨酸標準溶液10.00 mL,，用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL,，即得到100ug/ mL L－酪氨酸標準溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或立即使用,。 

3  儀器和設(shè)備 

3.1  恒溫水浴40±0.2℃,。 

3.2  美析紫外分光光度計UV-1700,。 

4  分析步驟 

4.1  求K值 

按下表配制不同濃度的L－酪氨酸標準溶液，然后,，直接用紫外分光光度計于275nm測定其吸光度（A）,，以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度c為橫坐標,，繪制標準曲線（此線應(yīng)通過零點）, 根據(jù)作圖或用回歸方程,，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量（μg），即為吸光常數(shù)K值;（其K值應(yīng)在（130～135）范圍內(nèi)）,。 管  號 

酪氨酸標準溶液的濃

度 （μg/mL） 

取100ug/mL酪氨酸標準溶液的體積 

mL 

取水的體積 

mL 

吸光值 Abs. 0 0 0 10  1 10 1 9  2 20 2 8  3 30 3 7  4 40 4 6  5 50 

5 

5 

4.2 測定 

吸取適量稀釋的酶液2.00mL,、酪素2.00mL、三lu.yi.suan4.00 mL,，其它操作條件同福林法測定中的反應(yīng),、靜止沉淀，直到過濾,。濾液用紫外分光光度計,，在275nm波長下，用10mm比色皿,，測定其吸光度（A）,。 

a、先將酷素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中,，預(yù)熱5min,； 

b、按下列程序操作： 

 試管A（空白）試管B（酶試樣,，需作三個平行試樣） 加酶液2.00 mL 加酶液2.00 mL 40±0.2℃,，2min 40±0.2℃，2min 

加三lu.yi.suan4.00 mL（搖勻）加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻） 40±0.2℃,，10min（計時）40±0.2℃,，10min（計時） 加酪素2.00mL(已預(yù)熱)（搖勻）加三lu.yi.suan4.00mL（搖勻） 繼續(xù)加熱10min，過濾或離心繼續(xù)加熱10min,，過濾或離心 于275nm波長,，測上清液吸光值于275nm波長,，測上清液吸光值 

c,、1.398和166蛋白酶，除反應(yīng)與顯色溫度為30±0.2℃外,，其它操作同 4.2,。標準曲線作同樣處理。 

5  計算 

在40℃下每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,定義為1個蛋白酶活力單位,。 

X＝A×K×8/2×1/10×n×E＝2/5×A×K×n×E 

式中：X——樣品的酶活力,，(u/mL),； 

      A——試樣溶液的平均吸光度；       K——吸光常數(shù),； 

      8——反應(yīng)試劑的總體積,，mL；       2——吸取酶液2.00mL,； 

      1/10——反應(yīng)時間10min,，以1min計；       n——稀釋倍數(shù) 

      E——紫外法與福林法的換算系數(shù)（中性,、堿性蛋白酶系數(shù)為0.50,；酸性蛋白酶系數(shù)

為0.77）。 

所得結(jié)果表示至整數(shù),。 6 結(jié)果的允許差 

平行試驗測定值之差不得超過3％,。