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分享一下超微量分光光度計(jì)在核酸定量上的應(yīng)用
今天跟大家分享一下超微量分光光度計(jì)在核酸定量上的應(yīng)用
核酸的定量是超微量分光光度計(jì)使用頻率的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,，單鏈,、雙鏈DNA，以及RNA,。
核酸的吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm,。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同,。定量不同類(lèi)型的核酸,，事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,，37μg/ml的ssDNA,，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig,。
測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,，選擇正確的程序,，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測(cè)試空白液和樣品液,。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順,。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問(wèn)題,。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大,。
事實(shí)上,，分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度,。如德國(guó)伯赫Colibri超微量分光光度計(jì)的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的,。
另外,，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等:在測(cè)試時(shí),，離子濃度太高,，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定,、離子濃度較低的緩沖液,，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù),。
樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果,。
為了大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值好在0.1-1.5A,。在此范圍內(nèi),，顆粒的干擾相對(duì)較小，結(jié)果穩(wěn)定,。從而意味著樣品的濃度不能過(guò)低,，或者過(guò)高(超過(guò)光度計(jì)的測(cè)試范圍)。后是操作因素,，如混合要充分,，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,，空白液無(wú)懸浮物,，否則讀數(shù)漂移劇烈;
必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng),。
除了核酸濃度,，分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值,，用于評(píng)估樣品的純度,，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,，比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA),。
如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響,。A230表示樣品中存在一些污染物,，如碳水化合物,，多肽，苯酚等,，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0,。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,，A320一般是0,。