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Juvi^TM  Human iPSC/ESC Growth Medium

BeYaMA^TM 1

Juvi^TM  Human iPSC/ESC Growth Medium

人多能干細胞無血清培養(yǎng)液*實驗操作手冊

• 培養(yǎng)皿包被

1. 4℃溶解Matrigel（BD 354277）6小時，輕搖混勻,。請注意：原液應是均質(zhì)粘稠的半流體狀態(tài),，要避免溫度過高，否則Matrigel會變成凝膠狀態(tài),。
2. 冰上預冷1.5ml離心管和移液器槍頭，冰上快速將Matrigel分裝成350-500ul/支,，儲存于-80℃,，用前置于4℃解凍。
3. 將溶解的Matrigel加入25ml預冷的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中,，輕輕混勻,，避免產(chǎn)生氣泡。
4. 將稀釋的Matrigel加入六孔板中,，1ml/孔,，輕搖培養(yǎng)板，使Matrigel均勻鋪在培養(yǎng)板底部,。
5. Parafilm封好包被的培養(yǎng)板,，至于4℃儲存，用前置于37℃培養(yǎng)箱中孵育至少1小時,。

• 培養(yǎng)液準備

1. 在4℃解凍BeYaMA^TM 1 5X Supplement（貨號：HJ0103M）添加劑,，加入BeYaMA^TM 1 Basal Medium（貨號：HJ0102M）基礎培養(yǎng)基中，形成500mL BeYaMA^TM 1 Complete Medium（貨號：HJ0101M）*培養(yǎng)基,。
2. BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)基可在4℃穩(wěn)定儲存2周,。可按實際用量將BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)基分裝后置于-80或-20℃保存,，避免反復凍融,。

• hESCs/hiPSCs復蘇

1. 復蘇hESCs/hiPSCs前，復溫Matrigel包被的培養(yǎng)板,，吸棄孔內(nèi)液體,，加入2ml BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)液及2ul 5uM/L Rock Inhibitor Y27632，用以促進細胞貼壁,。
2. 從液氮罐中取出hESCs/hiPSCs凍存管,，浸入37℃水浴,，輕輕搖晃，直到細胞融化至僅剩一小塊冰晶,，迅速取出并用75%酒精擦拭凍存管外表面,，轉(zhuǎn)移至無菌超凈臺中。
3. 將細胞懸液接種至準備好的培養(yǎng)板中,，輕輕晃動使細胞均勻分布在板底,。
4. 小心將培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱中，避免振動,。
5. 30-90min后顯微鏡下觀察細胞基本貼壁,，更換新鮮BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)液，之后每24h換液,，4-6天后傳代。

• hESCs/hiPSCs傳代

1. 提前準備好Matrigel（BD 354277）包被過的六孔板,，吸棄孔內(nèi)包被液,，加入2ml BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)液。
2. 吸棄待傳代hESCs/hiPSCs孔內(nèi)的培養(yǎng)液,，并用1ml無鈣鎂的PBS洗1遍,。
3. 加入0.5ml Accutase細胞分離液使之*覆蓋皿底。
4. 室溫孵育5-8分鐘或37℃孵育3-5分鐘,，顯微鏡下觀察到大部分克隆細胞間出現(xiàn)間隙,，細胞表面發(fā)亮但尚未相互分離時，可吸去Accutase,。
5. 可將培養(yǎng)板放置37℃繼續(xù)孵育1min,或者直接加入適量新鮮BeYaMA^TM 1*培養(yǎng)液,，輕輕搖晃，干細胞集落基本脫落,。亦可用細胞刮刀將剩余克隆輕輕刮下,，盡量避免用槍頭反復吹打細胞。
6. 將制備好的細胞懸液按1：3 - 1：6的比例接種至準備好的培養(yǎng)板中,，注意細胞過密則克隆邊界不圓滑,，易分化，細胞過稀則克隆存活率降低,。
7. 輕輕搖晃培養(yǎng)板讓細胞均勻分散,，置于37℃，5% CO²培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時,。
8. 每天更換培養(yǎng)液,，待細胞密度達到80%以上，或者克隆中央密度過大,，影響細胞生長時進行傳代,。

如果您在使用BeYaMA^TM 1  Juvi^TM Human iPSC/ESC Growth Medium 人多能干細胞無血清培養(yǎng)液的過程中,，有任何技術(shù)問題，我們開通了Juvi科學家技術(shù)團隊,，歡迎您發(fā)郵件到[email protected] 進行交流溝通,，我們的目標是：推動中國iPS干細胞技術(shù)走向產(chǎn)業(yè)和臨床！