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NEB E6300S cDNA第一鏈合成試劑盒 cDNA合成

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ProtoScript® cDNA 第一鏈合成試劑盒含兩種經(jīng)優(yōu)化的混合液：M-MuLV 酶混合液和 M-MuLV 反應(yīng)混合液,。M-MuLV 酶混合液含 M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶和小鼠 RNase 抑制劑,，M-MuLV 反應(yīng)混合液含 dNTP 和經(jīng)優(yōu)化的緩沖液。該試劑盒還包含兩種優(yōu)化的反轉(zhuǎn)錄引物和無核酸酶水,。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火,。經(jīng)優(yōu)化的隨機引物混合液能隨機并持續(xù)性地與整個 RNA 模板配對，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA,。合成的第一鏈 cDNA 產(chǎn)物長度可超過 10 kb

成功合成 cDNA 的要素：

RNA 模板
高純度的完整 RNA 對于靈敏的 RT-PCR 檢測至關(guān)重要,。RNA 的 A260/A280 比值應(yīng)至少 1.7 或更高。

總 RNA 或 mRNA 均可用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),?？?RNA 通常足以進(jìn)行大多數(shù) RT-PCR 分析。不過,，如果需要,，可以使用 PolyA Spin mRNA 分離試劑盒（NEB #S1560）或 mRNA 磁性分離試劑盒（NEB #S1550）獲得 mRNA。

檢測所需的 RNA 量取決于目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的豐度,。通常推薦使用 1 ng 至 1 μg 的總 RNA 或 0.1-100 ng 的 mRNA,。

cDNA 第一鏈合成反應(yīng)
RNA 和引物在 70℃ 條件下變性 5 分鐘，可以去除阻礙較長 cDNA 合成的二級結(jié)構(gòu)。不過,，可以在某些情況下省略此步驟（結(jié)果未發(fā)表）,。

推薦在 42℃ 條件下溫育一小時，以獲得最高產(chǎn)量和最大長度,。不過,，許多靶標(biāo)用較短的溫育時間即可進(jìn)行檢測。例如,，對于 2 kb cDNA 合成,，溫育 5 分鐘就足夠了。

選擇反轉(zhuǎn)錄引物
Oligo d(T) 引物是大多數(shù)實驗的首·選,，因為它確保所有 cDNA 拷貝在 mRNA 的 3′ 端終止并產(chǎn)生最長的連續(xù) cDNA,。錨定的 Oligo-dT 引物 [d(T)23VN] 迫使引物與 polyA 尾的起始端退火，從而防止在 polyA 尾的內(nèi)部位點開始退火（1）,。不過，如果需要,，也可以選擇另外兩種引物,。

隨機引物混合液是經(jīng)優(yōu)化的六聚體和 d(T)23VN 引物混合液。該混合液能隨機地與整個 RNA 模板配對,，包括 mRNA 和無 polyA 尾的 RNA（例如核糖體 RNA）,。隨機引物混合液產(chǎn)生的 cDNA 平均長度較短，可用于檢測多個短 RT-PCR 產(chǎn)物,。隨機引物混合液在各種 RNA 模板中均具有良好的性能,。

基因特異引物用于 cDNA 合成反應(yīng)時，cDNA 產(chǎn)物只能用于擴增該轉(zhuǎn)錄本,。RNA 起始量較低（低于 10 ng）且只需要一種特定的 cDNA 時,，使用這種方法可以獲得良好的結(jié)果。

推薦的引物濃度：
引物：終濃度
OLIGO d(T)23VN：5 μM
隨機引物混合液：6 μM
特異引物：0.1–1 μM

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產(chǎn)品應(yīng)用：
ProtoScript® First Strand cDNA Synthesis Kit 適用于以下應(yīng)用領(lǐng)域：

• 定量RT-PCR (qRT-PCR)： 利用高保真cDNA合成結(jié)果進(jìn)行定量基因表達(dá)分析,。

• 基因克?。?/strong> 在克隆實驗中用作RT-PCR的cDNA模板，確保高保真度,。

• 基因組學(xué)研究： 用于復(fù)雜基因組和轉(zhuǎn)錄組分析,，生成高質(zhì)量的cDNA片段。

• 病毒學(xué)研究： 適用于病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄,，生成高質(zhì)量cDNA供后續(xù)分析,。

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