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人外周血淋巴細胞培養(yǎng)原文鏈接：http://www.stemcell.so/article-1040.html

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干細胞搜網(wǎng)實驗室人員教您如何做好人外周血淋巴細胞培養(yǎng)：

在正常情況下，人外周血中是沒有分裂相的,，只有在異常情況下才能發(fā)現(xiàn),。植物血球 凝集素（PHA）是人類淋巴細胞有絲分裂的刺激劑，在PHA作用下,，原處于Go期的淋巴細胞轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞,，進而進行有絲分裂。利用PHA這一特性,，淋 巴細胞經(jīng)過含有HPA培養(yǎng)液培養(yǎng),，在體外便可獲得豐富的含有絲分裂的生長活躍的細胞群體,，終止分裂中期的淋巴細胞，例可得到所需的人體染色體圖形,。具有用 血量少,、操作簡單等優(yōu)點。

　　1,、實驗材料
　　2.5%碘酒,、75%酒精、無菌棉簽或棉球,、鑷子,、吸管、培養(yǎng)瓶,、培養(yǎng)液（PRMI 1640、M199）,、小牛血清,、秋水仙素、KCL,、甲醇,、冰醋酸、載玻片等,。

　　2,、培養(yǎng)液配制
　　無菌條件下配制培養(yǎng)液，每瓶所含下列試劑：
　　RPMI 1640或199 90%
　　小牛血清 10%
　　PHA（自制） 0.1ml 3%
　　肝素 10u/ml 2%
　　雙抗 100u/ml（選擇）
　　分裝于10ml培養(yǎng)瓶內(nèi),，每瓶5ml培養(yǎng)液,，封口置冷藏柜備用。

　　3,、操作過程
（1）采樣接種：用2.5%碘酒,、75%酒精消毒瓶蓋，用酒精燈火焰過烤,，無菌條件下抽取患者外周血0.5-1ml,，每瓶加20滴左右，輕搖均勻,，盡量避免培養(yǎng)物與瓶蓋接觸,；
（2）培養(yǎng)：置36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時，每隔12小時左右輕遙1次,，以促進細胞生長增殖,；
（3）抑止分裂：收獲前2小時左右加秋水仙素，zui終濃度為0.02ug/ml培養(yǎng)液,，搖勻后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),，以抑止細胞在分裂中期,。
（4）終止培養(yǎng)：從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，搖勻后移至10ml尖底離心管中,，盡量收集培養(yǎng)細胞,。2000rpm8分鐘。
（5）低滲處理：棄上清液,，加入預(yù)溫37℃的0.075MKCL8ml,，迅速打勻，置37℃培養(yǎng)箱或水浴鍋中10-20分鐘,；
（6）預(yù)固定：取出低滲中尖底離心管,，輕輕加入新配制的1-2ml 3∶2甲醇：冰乙酸混合液，取相應(yīng)編號滴管用汽泡輕輕軟打2-3下,。800-1000rpm8-10分鐘,；（7）固定：棄上清液。加入新鮮配制的3∶2甲 醇冰乙酸混合液10ml,，輕打混勻,，封口置室溫30分鐘以上。1500-2000rpm10分鐘,，反復(fù)2-3次,；
（8）制片：使用蒸餾水制備冰水片進行滴片。留離心后沉淀細胞,，加新鮮配制的固定液,，制成細胞懸液，取1-2滴滴片,，用于輕輕吹開,。刻號后清理刻號污物,，置80℃烤片2小時,；
（9）收片：待烤箱自然冷卻后，取出烤片,，置干凈環(huán)境中或培養(yǎng)箱中以備進行顯帶處理,。