流式細胞術（FlowCytometry）是一種用于分析細胞群體的實驗技術，能夠同時分析單個細胞的多個特性,。為了提高檢測的靈敏度和準確性,，細胞通常需要經(jīng)過固定（Fixation）和透化（Permeabilization）處理，以便檢測細胞內(nèi)的分子（如蛋白質(zhì),、DNA,、RNA等）。下面是流式細胞術中固定和透化的常見解決方案,。
一,、固定（Fixation）
固定的目的是保持細胞內(nèi)的結構和分子狀態(tài)，防止細胞在實驗過程中發(fā)生變化,，通常使用化學固定劑進行處理,。
常用的固定劑：
甲醛（Formaldehyde）
常用濃度：1-4%
作用：甲醛能夠通過與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)交聯(lián)，固定細胞的結構,。它對細胞膜和細胞內(nèi)部結構具有較強的穿透性,，常用于維持細胞形態(tài)和免疫標記物的穩(wěn)定性,。
使用方法：
將細胞懸浮液與適量甲醛溶液混合。
4°C保存固定的細胞,，避免固定時間過長,，通常固定時間為15-30分鐘。
固定后的細胞可用PBS洗滌,，并根據(jù)需要進行透化處理,。
乙醇（Ethanol）
常用濃度：70%（體積分數(shù)）
作用：乙醇是一種廣泛使用的固定劑，適合固定DNA,、RNA等分子,，并能固定細胞形態(tài)。乙醇的優(yōu)勢在于其良好的穿透性和與細胞膜的作用方式,，可以同時破壞細胞膜,，適用于之后的透化步驟。
使用方法：
細胞懸浮液加入70%乙醇,，輕輕混勻,。
在-20°C或4°C保存固定的細胞，常見的固定時間為30分鐘到1小時,。
固定后的細胞可用PBS洗滌,，并進行透化處理。
固定后注意事項：
固定細胞后需要盡快進行透化處理,，避免固定過度導致標記失效,。
固定過程中要保持溫度低（4°C）以減少細胞損傷。
固定劑的濃度和時間對流式細胞術結果有很大影響,，需要優(yōu)化,。
二、透化（Permeabilization）
透化的目的是使細胞膜或細胞內(nèi)的膜結構變得可滲透,，從而使抗體或探針能夠進入細胞內(nèi)部,，標記細胞內(nèi)的分子。
常用的透化劑：
TritonX-100
濃度：0.1%-0.5%
作用：TritonX-100是一種非離子表面活性劑,，能夠有效地破壞細胞膜,，使抗體能夠進入細胞。它對細胞膜有較強的破壞作用,，可以透化大多數(shù)細胞類型,。
使用方法：
固定后的細胞加入0.1%-0.5%TritonX-100溶液，輕輕混勻,。
在室溫下孵育10-20分鐘,，或根據(jù)實驗需要優(yōu)化透化時間。
孵育后，細胞用PBS洗滌,，去除透化劑,。
Saponin
濃度：0.05%-0.1%
作用：Saponin是一種植物來源的透化劑，作用較為溫和,，常用于細胞內(nèi)標記物的檢測,，特別是在對細胞膜破壞較為敏感的實驗中。它通過選擇性地破壞細胞膜的膽固醇組成,，打開細胞膜上的孔隙,。
使用方法：
固定后的細胞加入0.05%-0.1%Saponin溶液。
在室溫下孵育5-10分鐘,，透化效果較溫和,。
孵育后，用PBS洗滌細胞,。
Methanol（甲醇）
濃度：100%
作用：甲醇是一種常見的透化劑,，特別適用于細胞內(nèi)蛋白的檢測。它通過抽提細胞內(nèi)的脂質(zhì)成分,，從而使抗體能夠進入細胞,。甲醇透化較強，但有可能破壞細胞內(nèi)的某些結構,，因此通常用于固定后透化。
使用方法：
固定后的細胞加入冷卻的100%甲醇,。
在-20°C保存30分鐘或更長時間,。
完成透化后，用PBS洗滌,。
透化后注意事項：
透化時間和濃度過長可能會導致細胞膜或細胞內(nèi)部結構的過度破壞,，影響實驗結果。
不同細胞類型對透化劑的反應不同,，可能需要優(yōu)化透化條件,。
透化和固定處理后，應盡量避免長時間暴露在室溫下,，避免細胞損傷,。
三、固定與透化的綜合流程
細胞培養(yǎng)與收集
收集待檢測的細胞,，使用PBS洗滌去除培養(yǎng)基,。
固定處理
根據(jù)實驗需要選擇固定劑（如甲醛、乙醇等）,。
按照推薦的濃度和時間對細胞進行固定,。
固定后使用PBS洗滌細胞。
透化處理
根據(jù)實驗要求選擇透化劑（如TritonX-100、Saponin,、Methanol等）,。
按照推薦濃度和時間對細胞進行透化。
透化后用PBS洗滌細胞,，去除透化劑,。
抗體染色與檢測
固定和透化后的細胞可以進行表面標記或內(nèi)部分子標記。
使用適當?shù)臒晒鈽擞浛贵w,，進行流式細胞術分析,。
四、總結
在流式細胞術中,，細胞固定和透化是兩個非常關鍵的步驟,。固定劑能夠保持細胞結構并防止分子降解，而透化劑能夠使抗體或其他探針進入細胞,，標記內(nèi)部分子,。選擇適當?shù)墓潭ê屯富瘲l件對于確保實驗的準確性和重復性至關重要。因此,，建議根據(jù)細胞類型,、實驗目標和抗體性質(zhì)來優(yōu)化固定和透化的方案。
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