日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)是指將外源分子如DNA,，RNA等導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究的不斷發(fā)展,，轉(zhuǎn)染已經(jīng)成為研究和控制真核細(xì)胞基因功能的常規(guī)工具,。在研究基因功能、調(diào)控基因表達(dá),、突變分析和蛋白質(zhì)生產(chǎn)等生物學(xué)試驗中,，其應(yīng)用越來越廣泛。影響轉(zhuǎn)染效率的因素有很多,細(xì)胞株本身的特性和活性,，細(xì)胞培養(yǎng)條件,轉(zhuǎn)染的DNA或RNA的質(zhì)量,，轉(zhuǎn)染方法，轉(zhuǎn)染試劑的選擇等,。

轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響,，主要因素有下面幾個:

1．轉(zhuǎn)染試劑

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，但細(xì)胞系的選擇通常是根據(jù)實驗的需要,，因此在轉(zhuǎn)染實驗前應(yīng)根據(jù)實驗要求和細(xì)胞特性選擇適合的轉(zhuǎn)染試劑,。當(dāng)然，是高效,、低毒,、方便、廉價的轉(zhuǎn)染試劑,。

2．細(xì)胞狀態(tài)

一般低的細(xì)胞代數(shù)（<50）能確?；蛐筒蛔?。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是經(jīng)過幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長期的細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛,，最容易轉(zhuǎn)染,。細(xì)胞培養(yǎng)在實驗室中保存數(shù)月和數(shù)年后會經(jīng)歷突變，總?cè)旧w重組或基因調(diào)控變化等而演化,。

3．轉(zhuǎn)染方法

轉(zhuǎn)染時應(yīng)跟據(jù)具體轉(zhuǎn)染試劑推薦的方法,，但也要注意，因不同實驗室培養(yǎng)的細(xì)胞性質(zhì)不同,，質(zhì)粒定量差異,，操作手法上的差異等，其轉(zhuǎn)染效果可能不同,，應(yīng)根據(jù)實驗室的具體條件來確定最佳轉(zhuǎn)染條件,。

(1）細(xì)胞培養(yǎng)物

不同細(xì)胞有不同的培養(yǎng)基，血清和添加物,。高的轉(zhuǎn)染效率需要一定的細(xì)胞密度,，一般的轉(zhuǎn)染試劑都會有專門的說明。推薦在轉(zhuǎn)染前24小時分細(xì)胞,，這將提供正常細(xì)胞代謝,，增加對外源DNA攝入的可能。一定要避免細(xì)菌,，支原體或真菌的污染,。

(2）細(xì)胞密度

不同的轉(zhuǎn)染試劑，要求轉(zhuǎn)染時的最適細(xì)胞密度各不相同,，即使同一種試劑,，也會因不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因此如果選用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑,，最好能夠進(jìn)行優(yōu)化實驗并為以后的實驗建立一個穩(wěn)定方法,包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時間等等,。陽離子脂質(zhì)體具有微量的細(xì)胞毒性而往往需要更高的鋪板密度或者更多的懸浮細(xì)胞數(shù)，有的要求細(xì)胞90%匯片;而有些多胺或者非脂質(zhì)體的配方則要求在40%-80%之間,，總之是盡導(dǎo)致和轉(zhuǎn)染相關(guān)的細(xì)胞行為的變化,。

(3）血清

轉(zhuǎn)染產(chǎn)品配方幾經(jīng)革新后的今天，對于主流的轉(zhuǎn)染試劑來說,，血清的存在已經(jīng)不會影響轉(zhuǎn)染效率,，甚至還有助于提高轉(zhuǎn)染效率，如陽離子聚合物等,，血清的存在會影響DNA一轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成,但只要在DNA-轉(zhuǎn)染復(fù)合物形成時用無血清培養(yǎng)基或PBS來稀釋DNA和轉(zhuǎn)染試劑就可以了,，在轉(zhuǎn)染過程中是可以使用血清的。不過要特別注意:對于RNA轉(zhuǎn)染,，如何消除血清中潛在的RNase污染是值得關(guān)注的,。胎牛血清（FCS）經(jīng)常用到,，便宜一點(diǎn)的有馬或牛血清。

(4）抗生素

目前轉(zhuǎn)染試劑因為全程都可以用有血清和抗生素等添加劑的*培養(yǎng)基來操作,，非常方便,，省去了污染等麻煩。

(5)氮磷（N/P)比

N/P比是轉(zhuǎn)染效率的關(guān)鍵（為了換算方便,，一般以DNA/轉(zhuǎn)染試劑質(zhì)量比表示),，在一定比例范圍內(nèi)轉(zhuǎn)染效率隨N/P比成比例增高，之后達(dá)到平值,，但毒性也隨之而增加,，因此在實驗之前應(yīng)根據(jù)推薦比例，確定本實驗的最佳轉(zhuǎn)染比例,。

(6）DNA質(zhì)量

DNA質(zhì)量對轉(zhuǎn)染效率影響非常大。一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)(如脂質(zhì)體等)基于電荷吸引原理,，如果DNA不純,，如帶少量的鹽離子，蛋白,，代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復(fù)合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進(jìn)行,。

4．載體構(gòu)建

轉(zhuǎn)染載體的構(gòu)建（病毒載體，質(zhì)粒.DNA,，RNA,，PCR產(chǎn)物，寡核苷酸等）也影響轉(zhuǎn)染結(jié)果,。病毒載體對特定宿主細(xì)胞感染效率較高,，但不同病毒載體有其特定的宿主，有的還要求特定的細(xì)胞周期,，如逆轉(zhuǎn)錄病毒需侵染分裂期的宿主細(xì)胞,，此外還需考慮一些安全問題（如基因污染)。除載體構(gòu)建外,，載體的形態(tài)及大小對轉(zhuǎn)染效率也有不同的影響,，如前面提到的超螺旋及線性DNA對瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的影響。如果基因產(chǎn)物對細(xì)胞有毒性作用,，轉(zhuǎn)染也很難進(jìn)行,，因此選擇組成或可調(diào)控，強(qiáng)度合適的啟動子也很重要,，同時做空載體及其它基因的相同載體構(gòu)建的轉(zhuǎn)染正對照可排除毒性影響的干擾,。