今天小編給大家簡述一下流式細胞儀檢測的工作原理，希望對您的實驗工作有所幫助,！
儀器設(shè)備：
在流式細胞術(shù)中使用的儀器稱為流式細胞分析儀,，通?？s寫為“細胞分析儀"。流式細胞分析儀由一個用于進行細胞處理的流體系統(tǒng)和一個包括數(shù)據(jù)采集信號檢測器和處理器的光學(xué)系統(tǒng)組成,。專為 FACS 設(shè)計的儀器還包含一個細胞分選組件,，該組件可將細胞引導(dǎo)到不同的捕獲容器中。
流體系統(tǒng)設(shè)計用于生成單細胞的均勻流,，以確保當(dāng)細胞被用于檢測的光源照射時,，能夠進行適當(dāng)分析。這通過使用加壓管將細胞從樣品管注入流室中來完成,。從容器（通常是一根試管或一塊多孔板）中抽取細胞樣品,，并將其注入流動液體（稱為鞘液）層流中間的流室中。通過一個稱為流體動力學(xué)聚焦的流程,，鞘液可幫助縮窄細胞流,，從而將細胞組織成一行大致單行的流線。
流式細胞分析儀的光學(xué)系統(tǒng)包括照明源,、過濾器,、透鏡和收集光學(xué)器件。照明源常包括 1 個或多個激光束,，且每個激光器發(fā)射的光波長不同,。檢測器不區(qū)分各種光波長，而是通過放置在光路徑中的過濾器來將光限制在所需波長范圍內(nèi),。
相關(guān)試劑：
為了通過流式細胞術(shù)分析特定靶標(biāo),，對細胞組分進行熒光標(biāo)記。這可以通過使用單獨的熒光分子（例如,，細胞染料）或熒光團標(biāo)記的抗體（直接偶聯(lián)抗體或使用偶聯(lián)二抗）來完成,。
1.流式細胞術(shù)中抗體的使用
抗體是許多生物檢測中的關(guān)鍵工具，在流式細胞術(shù)中也不例外,?？贵w具有特異性結(jié)合單個蛋白或蛋白修飾的能力，并且可作為一種方法來標(biāo)記那些用于進行檢測的靶標(biāo),。通過標(biāo)記目的靶標(biāo),，研究人員可以評估各種細胞類型、疾病狀態(tài),、治療條件、發(fā)育階段或其他生物模型中蛋白的豐度或活性,。與不同蛋白結(jié)合的抗體不會相互干擾,，因此，可以使用多種抗體同時檢測多個靶標(biāo),。這稱為多重分析,?？贵w數(shù)量的限制是獨立于其他抗體測定每種抗體的能力。在流式細胞術(shù)中,，這種差分測定使用稱為熒光團的熒光分子來完成,。成功的實驗要求具有高度特異性和經(jīng)驗證的抗體以及可靠的熒光團。
2.流式細胞術(shù)中熒光團的使用
熒光團的共同特性是能夠發(fā)射與用于照亮染料的光相比波長更長的光,。例如,，如果使用藍色激光器來照亮稱為綠色熒光蛋白 (GFP) 的分子，那么蛋白會吸收藍光并發(fā)射綠光,。被吸收的光與被發(fā)射的光之間的波長差異稱為斯托克斯位移,。
就是這種位移讓人們能夠準確定量來自熒光團的光，因為它能夠過濾來自激發(fā)源的光的波長,。激發(fā)源總是比從正在分析的熒光團中發(fā)射的熒光更亮些,，并且如果這種光無法移除，那么它將會強烈影響檢測器,。
熒光染料吸收的光的范圍稱為“激發(fā)"光譜,，而激發(fā)時其發(fā)出的熒光稱為“發(fā)射"光譜。激發(fā)和發(fā)射光譜針對所有常見染料提供,，并呈曲線顯示各波長下吸收或發(fā)射的光量,。
3.偶聯(lián)抗體
通常，在流式細胞術(shù)實驗中用于獲取讀數(shù)的熒光團會與抗體共價結(jié)合,。該過程稱為偶聯(lián),，并且該抗體-熒光團配對稱為偶聯(lián)物。當(dāng)在一項細胞檢測中使用偶聯(lián)抗體時,，熒光團發(fā)射的光可作為細胞內(nèi)或細胞上存在的抗體量的一個直接指標(biāo),。（由于細胞膜是透光的，細胞內(nèi)熒光團發(fā)射的光不會顯著衰減,。）通過使用特異性結(jié)合蛋白或蛋白修飾的偶聯(lián)物,，研究人員可以根據(jù)每個細胞發(fā)射的熒光水平，直接量化該細胞中的目的靶標(biāo),。該過程稱為直接檢測或直接流式細胞術(shù),。
流式細胞術(shù)的直接與間接染色
直接：直接偶聯(lián)抗體
可直接多重分析來自同一宿主的抗體
由于孵育和洗滌步驟更少，因此實驗步驟更快
能夠在一項檢測中使用許多不同的抗體,，從而能夠同時讀取大量終點
間接：非偶聯(lián)一抗 + 偶聯(lián)二抗
可改善以低豐度存在的靶標(biāo)的檢測,，同時由于二次放大可提供更高的靈敏度（多個二抗結(jié)合一個一抗）
當(dāng)直接偶聯(lián)物尚未獲得時，有益于一抗的初始驗證
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