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應(yīng)用分享丨冷凍電鏡推進(jìn)離子通道蛋白研究
離子通道是一類廣泛的蛋白復(fù)合物,，作為細(xì)胞膜上的開(kāi)口，離子通道使各種離子在細(xì)胞內(nèi)部和細(xì)胞外介質(zhì)之間交換并加以調(diào)節(jié),。這些通道在細(xì)胞維持和穩(wěn)態(tài)中起到了*的作用,。離子通道的失調(diào)與大量的疾病（也稱為離子通道?。┯嘘P(guān),，包括癌癥、癡呆癥,、糖尿病,、哮喘等等。離子通道是藥物設(shè)計(jì)中的一大難題,，主要原因在于其選擇性抑制劑的設(shè)計(jì)具有一定難度,，藥物缺乏特異性會(huì)對(duì)其它關(guān)鍵的、結(jié)構(gòu)類似的離子通道產(chǎn)生負(fù)面影響,。
冷凍電鏡圖
從膜面看 SARS-CoV-2 3a 離子通道在脂質(zhì)納米盤(pán)中的 2.9? 分辨率的模型,。圖為David M. Kern 等人在脂質(zhì)納米盤(pán)中 SARS-CoV-2 3a 離子通道的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)圖，可在CC BY 4.0下使用,。
作為膜蛋白,，離子通道對(duì)傳統(tǒng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)（如 X 射線晶體學(xué)）有一定的挑戰(zhàn),。首先，這些復(fù)合物往往（至少部分）依靠膜來(lái)維持它們的結(jié)構(gòu),，而將它們分離出來(lái)進(jìn)行結(jié)晶會(huì)破壞它們的原始狀態(tài),。更關(guān)鍵的是，離子通道的不同構(gòu)象對(duì)藥物研發(fā)至關(guān)重要,，因?yàn)樗鼈兘沂玖穗x子通道的結(jié)合點(diǎn)以及過(guò)渡狀態(tài),。任何無(wú)法區(qū)分這些構(gòu)象的研究方法，都難以基于結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì),。
冷凍電鏡 (cryo-EM) 包含一系列技術(shù),，包括單顆粒分析、冷凍電子斷層掃描和微電子衍射,。在離子通道的研究中,，冷凍電鏡對(duì)嵌入納米盤(pán)中的通道蛋白復(fù)合物進(jìn)行單顆粒分析。納米盤(pán)的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)模仿了細(xì)胞膜的形態(tài),，有助于保持離子通道的原始狀態(tài),。冷凍電鏡從不同角度對(duì)數(shù)以千計(jì)的樣品顆粒進(jìn)行成像，然后對(duì)這些二維圖像進(jìn)行三維重構(gòu),。由于圖像可以被分類和分組,，離子通道的不同構(gòu)象可以被分離出來(lái)，并單獨(dú)進(jìn)行分析和重構(gòu),，以獲得不同構(gòu)象的結(jié)構(gòu),。
冷凍電鏡的分辨率和質(zhì)量足以展現(xiàn)激動(dòng)劑和拮抗劑分子與離子通道的結(jié)合，揭示了潛在治療受體的精確位置和構(gòu)象,。以下是制藥公司利用冷凍電鏡技術(shù)研究離子通道,、推進(jìn)基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)的幾個(gè)例子：
經(jīng)典瞬時(shí)受體電位 (TRPC) 蛋白構(gòu)成了一個(gè)非特異性陽(yáng)離子通道家族，與多種病理現(xiàn)象相關(guān),。盡管TRPC具有疾病治療潛力,，但其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制在很大程度上仍然是未知的。Amgen公司的研究人員利用冷凍電鏡,，不僅得到了 TRPC6 的高分辨率結(jié)構(gòu),，而且還確定了其與拮抗劑和激動(dòng)劑結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。通過(guò)確定這些識(shí)別位點(diǎn),，Amgen公司為未來(lái)針對(duì) TRPC 相關(guān)疾病的藥物設(shè)計(jì)鋪平了道路,。
TRPC6 的電子密度圖 (A) 和疊加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) (B) ，紫紅色為結(jié)合的激動(dòng)劑,。圖為 Yonghong Bai 等人的 TRPC6 通道藥理調(diào)節(jié)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),，可在CC BY 4.0下使用。
電壓門(mén)控鈉離子 (Nav) 通道是藥物研究的一個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域,，因?yàn)樗粌H是毒素和治療劑的作用靶標(biāo),，并且容易發(fā)生疾病突變,。值得注意的是，該通道的突變與偏頭痛,、癲癇,、疼痛以及心臟和肌肉麻痹綜合征有關(guān)。然而,，科學(xué)家對(duì)該通道的機(jī)械行為仍然知之甚少,。基因泰克公司（羅氏集團(tuán)）的研究人員利用冷凍電鏡研究了 Nav7 與 Protoxin II (ProTx2) 的相互作用,。ProTx2 是一種從秘魯綠絨蛛中分離出來(lái)的通道拮抗劑,。研究人員解析了激活和失活狀態(tài)下的 Nav1.7 結(jié)構(gòu)，為開(kāi)發(fā)特異治療性的 Nav 拮抗劑提供了一個(gè)重要的起點(diǎn),。
冷凍電鏡清晰地展示了與 ProTx2 拮抗劑結(jié)合的激活態(tài)（藍(lán)色/紫紅色）和失活態(tài)（黑色）的 Nav1.7 離子通道之間的結(jié)構(gòu)差異,。圖片基于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) (PDB) 6N4R 和 6N4Q，采用 PyMOL創(chuàng)建,。
上述研究成果表明,，冷凍電鏡在解決長(zhǎng)期疑難問(wèn)題——膜結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能方面上有著巨大潛力。現(xiàn)在有越來(lái)越多采用冷凍電鏡測(cè)定的離子通道結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中,，這表明研究人員對(duì)于該技術(shù)的興趣和使用都在不斷增加,。基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計(jì)不僅僅是跟隨這一趨勢(shì),，更多地指引了這一趨勢(shì),，其新研究成果將為下一代治療方法提供參考,。
來(lái)源：蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（2020 年 9 月 10 日）