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背景部分介紹：

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種骨髓(BM)漿細胞(PCs)的腫瘤，其分泌單克隆免疫球蛋白，誘導多器官損傷。MM主要發(fā)生在老年人中，前兆階段包括兩種類型，一種稱為意義不明的單克隆γ病(MGUS),；另一種是MGUS向MM進展的一個過渡階段，稱為陰燃型多發(fā)性骨髓瘤(SMM),。了解從前驅(qū)疾病發(fā)展為臨床活動性MM的機制可能有助于對特定人群實施早期治療,。

遺傳異質(zhì)性是MM的一個標志。免疫球蛋白編碼基因的染色體易位和高二倍體被認為是早期遺傳事件,，隨后是NF-κB,、MAPK-RAS和凋亡通路的異常，從而促進wan全惡性MM表型,。晚期遺傳改變通常涉及MYC和TP53基因,，這些基因在復發(fā)/難治性MM中通常發(fā)生改變。根據(jù)遺傳特征,，多發(fā)性骨髓瘤被分為不同的風險組,，表現(xiàn)出不同的標準治療結(jié)果。在這種情況下,，原發(fā)性遺傳病變的獲得順序,，以及它們?nèi)绾未龠MMM從前體狀態(tài)進展，尚未wan全闡明,。除了遺傳學,，越來越多的證據(jù)表明，腫瘤PCs的存活在很大程度上取決于它們所在的骨髓造血細胞生態(tài)位的相互作用,。因此,，腫瘤抑制微環(huán)境提供了有效的監(jiān)測，以限制MGUS和SMM階段的PC生長,，而進行性免疫編輯導致T細胞衰竭是MM轉(zhuǎn)化的基礎,。然而，在進展過程中,，遺傳多樣性的腫瘤細胞與基底細胞微環(huán)境相互作用以逃避免疫監(jiān)視的機制在很大程度上是未知的,。

解決這些科學問題具有臨床意義，因為盡管MM的生存率不斷提高,，但治愈仍然難以捉摸,，大多數(shù)MM患者最終會復發(fā)。單克隆抗體免疫治療新策略,，T細胞接合劑和嵌合抗原受體T細胞療法有望更長期地控制MM,，這可能最終導致治愈,。然而，這種治療效果與MM患者對免疫檢查點抑制劑的低應答率形成鮮明對比,。迫切需要破解不同免疫治療方法差異結(jié)果背后的機制。然而,，由于缺乏能夠概括MM的主要臨床,、遺傳和免疫學特征的實驗小鼠模型，這項研究受到了嚴重的阻礙,。在這種情況下,，在小鼠中產(chǎn)生MM的主要障礙是不確定疾病的起源細胞和啟動和維持轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵遺傳驅(qū)動因素。缺乏小鼠MM模型限制了臨床前免疫治療研究,，這構(gòu)成了當前未滿足的醫(yī)療需求,。

在這里，作者介紹了15種基因工程小鼠模型,，這些模型反映了該疾病發(fā)病機制的關(guān)鍵因素：遺傳異質(zhì)性,，MGUS和SMM狀態(tài)向臨床活動性疾病的進展轉(zhuǎn)變，以及腫瘤細胞在轉(zhuǎn)化過程中與BM免疫微環(huán)境的相互作用,。研究結(jié)果表明,，MYC是遺傳異質(zhì)性MM腫瘤和免疫進展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它決定了免疫治療的臨床反應,。

主要結(jié)果總結(jié)：

●對多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)重要驅(qū)動因子進行小鼠模型的建立

●通過轉(zhuǎn)錄組分析揭示疾病進展的SMUG,、SMM、MM時期相關(guān)性及具有疾病促進作用重要基因MYC的功能

●MAPK-MYC軸對MM的調(diào)控

●MM進展過程中發(fā)生了BM微環(huán)境重塑（T cell,，NK cell浸潤）

●MM的遺傳異質(zhì)性導致對ICB治療響應的不同

●提出CD8+T/Treg,，作為檢測及評估治療的生物標志物

結(jié)果具體介紹：

1.小鼠多發(fā)性骨髓瘤的遺傳異質(zhì)性建模

為了建立遺傳多樣性MM的臨床前模型，將攜帶8種MM遺傳驅(qū)動因子的轉(zhuǎn)基因小鼠培育成具有單,、雙和三重遺傳改變的工程菌株,，這些基因驅(qū)動因子概括了人類MM中最常見的變，其中包括通過IKBKB/IKK2表達激活NF-κB信號,，KRASG12D突變,，抗凋亡BCL2表達，c-MYC表達,，TP53缺失,，以及分別模擬免疫球蛋白易位t(11;14)， t(16;14)和t(4;14)的cyclin D1, c-MAF和MMSET/NSD2的組成性表達,。用綿羊紅細胞(SRBC)免疫幼鼠,，然后監(jiān)測小鼠12個月大時MM的發(fā)育情況a。其中3個系顯示BM中wan全滲透的PC腫瘤,，這縮短了中位總生存期(mOS)至12個月以下，其中兩種小鼠系被命名為MImb1和MIcγ1，因為它們分別通過mb1-cre或cγ1-cre等位基因表達MYC和IKK2NF-κB,，第三個小鼠系被命名為BIcγ1,，因為它通過cγ1-cre等位基因表達了BCL2和IKK2NF-κB b。3種不同細胞系的BM腫瘤由>10% GFP+CD138+B220?sIgM?PCs組成,，形態(tài)與人MM細胞相似,，在BM內(nèi)呈多灶浸潤模式;它們也表達典型的MM標記，包括酸性磷酸酶,、Bcma,、Slamf7和Taci，分泌免疫球蛋白到血清中,，并表現(xiàn)出克隆性IghV基因重排c-f,。然而，雖然BIcγ1和MIcγ1菌株主要分泌IgG或IgA,，但來自未成熟前b細胞的MImb1小鼠出現(xiàn)IgM分泌表型g,。

為了構(gòu)建MM遺傳異質(zhì)性，將BIcγ1和MIcγ1小鼠與攜帶其他MM遺傳變化的種系雜交,，這些遺傳異常均縮短了BIcγ1和MIcγ1小鼠的MM發(fā)育時間,，誘導了一種由GFP+CD138+B220- sIgM- PCs組成的BM疾病，分泌IgG或IgA,，并被歸類為MM h-i,。接下來，確定小鼠模型是否會像人類一樣,，在出現(xiàn)MM癥狀之前就存在前體疾病,。在BIcγ1和其衍生的小鼠中，形成致命MM前,，在6個月大的時候均經(jīng)過了MGUS樣階段,，其特征是很少有寡克隆GFP+CD138+B220- sIgM- PCs浸潤的BM,，這些細胞適度地向血清中分泌類型轉(zhuǎn)換的免疫球蛋白k-l,。

2. 小鼠多發(fā)性骨髓瘤的轉(zhuǎn)錄和基因組分析

為了確定正常BM PC的共同轉(zhuǎn)錄特征，對模型小鼠的MGUS和MM期細胞進行RNA-seq,， PC基因包括(Prdm1,、Irf4,、Xbp1、Sdc1編碼Cd138,、Tnfrsf17編碼Bcma,、Tnfrsf13b編碼Taci和Slamf7)的上調(diào)和B細胞基因的下調(diào)a。為了比較小鼠腫瘤與人類疾病,，將RNA-seq應用于新診斷的MGUS和MM患者的惡性PCs,，以確定與正常BM PCs相比的轉(zhuǎn)錄特征,。利用主成分分析(PCA)，發(fā)現(xiàn)小鼠和人類MGUS細胞定位在PC和MM之間,，這表明它們具有相似的進化轉(zhuǎn)錄軌跡b,。對比發(fā)現(xiàn)，BIcγ1來源的小鼠表現(xiàn)出線性的轉(zhuǎn)錄進化,，從BM細胞到MGUS細胞再到MM細胞,，與晚期進展一致。而MIcγ1小鼠的MGUS和MM細胞緊密聚集,，差異表達基因數(shù)量減少,，與快速進展一致c,。比較兩種模型發(fā)現(xiàn),，MYC在MM期表達較高，但在BIcγ1小鼠的MGUS期表達卻相對很低d,。MM轉(zhuǎn)錄組的GSEA發(fā)現(xiàn)“MYC靶基因"在兩種模型中都是最重要的標志e,。因此，MYC蛋白表達在原代骨髓MM細胞和從原代骨髓樣本建立的MM衍生細胞系中,，包括早期和晚期進展者f,。這些結(jié)果表明，在BIcγ1模型中,，內(nèi)源性MYC表達在MM進展過程中獲得,，而MIcγ1小鼠中轉(zhuǎn)基因MYC的早期激活加速了MM進展。同樣,，在患者中,，MYC在MGUS細胞中的表達水平與BM PCs相似，而在MM細胞中表達水平升高,，這與先前的研究一致,，證實了MYC調(diào)節(jié)進展為MM的時間加快g。

小鼠MM細胞的遺傳特征顯示核型為三倍體,、四倍體或復雜的非整倍體,，并伴有反復的染色體獲得和損失以及結(jié)構(gòu)重排h-i。其中包括62例MM原代樣品中的11例(18%)和6例MM衍生細胞系中的3例(50%)MYC與Igh或Igl基因之間的類似人類易位j,。然后,，作者評估了MYC在遺傳多樣性MM衍生細胞系中的致癌功能。用小分子MYCi975選擇性靶向MYC誘導劑量依賴性MYC蛋白還原30,31,，從而降低小鼠和人MM細胞的活力k,。

3. MAPK-MYC軸指示多發(fā)性骨髓瘤的進展

通過全外顯子組測序(WES)對腫瘤突變負荷(TMB)進行量化，62只小鼠中有29只（47%）在MM期觀察到MAPK通路基因突變,；這些比率與MM患者中觀察到的相似,，這表明該信號級聯(lián)的突變在MM進展過程中積累a,。早期和晚期MM細胞模型的基因組特征分析顯示，MIcγ1小鼠的核型正常,，沒有MYC易位,，而Trp53缺失的BIcγ1小鼠與未缺失Trp53的小鼠相比，染色體異常更豐富,，TMB更高,，表明TP53驅(qū)動的遺傳不穩(wěn)定性促進了MM進展過程中的遺傳重排b。接下來,，對比獲得性MAPK突變在小鼠和人類MM中是否類似,。western blot分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠和人mm來源的細胞系中,，蛋白激酶ERK (MAPK激活的替代物)的磷酸化一致c,。曲美替尼(MEK-ERK inhibitor),逆轉(zhuǎn)ERK磷酸化，降低小鼠和人MM細胞的生長,，這表明共享MAPK激活d-e,。鑒于在小鼠MM發(fā)育過程中獲得了MAPK通路突變和MYC激活，研究MAPK信號是否可以調(diào)節(jié)MYC的表達是必要的,。發(fā)現(xiàn)盡管曲美替尼在RNA水平上并沒有持續(xù)改變MYC基因的表達,，但MEK抑制降低了MYC Ser62位點的磷酸化，從而誘導了劑量依賴性MYC降解f,。

4. 多發(fā)性骨髓瘤進展的免疫特征

為了從模型中獲得進一步的見解,，通過多參數(shù)流式細胞術(shù)測定了不同基因型小鼠在順序疾病階段的BM免疫微環(huán)境的順序變化。在進展過程中觀察到T淋巴細胞和NK數(shù)量的線性增加,，這與PC擴增相關(guān)a-b,。由于在不同小鼠品系的BM微環(huán)境中觀察到廣泛的T細胞和NK細胞浸潤，我們根據(jù)T細胞和NK細胞的豐度對MM病例進行了劃分（low,，high）c,。42%MM病例表現(xiàn)出與健康小鼠骨髓微環(huán)境相似的免疫細胞浸潤，58%病例表現(xiàn)出更豐富的淋巴樣細胞,，主要是表型耗竭的CD8+ T淋巴細胞d,。此外，浸潤high組病例含有更多的免疫抑制性CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞,，CD8+ T淋巴細胞的負荷與Treg細胞的數(shù)量相關(guān),，這表明T細胞的細胞毒性和免疫抑制狀態(tài)在小鼠MM發(fā)育過程中相互作用d。

為了探索與人類疾病的相似之處,，對病人相關(guān)樣本進行了相同的檢測,，結(jié)果與小鼠模型一致e-h。接下來,，作者研究了這些類別是否與小鼠和患者的MM生物學和臨床特征相關(guān),。免疫浸潤細胞數(shù)量較多的病例血清中單克隆免疫球蛋白水平較高,，作為MM細胞負荷增加的替代指標i。此外,，骨髓免疫表型與年齡相關(guān),，骨髓浸潤T、NK淋巴細胞的數(shù)量與年齡呈負相關(guān)j,。然而,，在小鼠模型和人類中，腫瘤反應性淋巴細胞浸潤的分布在MM遺傳亞群中是相似的,，包括標準風險和高風險類別k,。

5. 多發(fā)性骨髓瘤MM的免疫治療響應

為了檢測小鼠模型的早期和晚期MM進展是否會影響對免疫治療的反應，特別是對免疫檢查點阻斷(ICB)治療的反應,，對MIcγ1小鼠進行抗pd -1治療,，從MGUS期開始，持續(xù)8周,，發(fā)現(xiàn)顯著降了低腫瘤負荷,，延遲了MM的發(fā)展a,。相反BIcγ1小鼠在治療中沒有引起反應b,。抗TIGIT單克隆抗體的類似治療策略在兩種小鼠模型中均未產(chǎn)生治療效果a-b,。研究了前驅(qū)期BM微環(huán)境的組成是否會對免疫檢查點治療產(chǎn)生調(diào)節(jié)反應,。MIcγ1小鼠表現(xiàn)出更高的活化PD-1+、TIGIT+和LAG3+ CD8+ T淋巴細胞數(shù)量較BIcγ1小鼠,，但免疫抑制CD4+PD-1+ Treg細胞數(shù)量也較低c-d,。CD8+ T細胞與Treg細胞的比例在MIcγ1小鼠中較高e。為了探討患者體內(nèi)細胞毒性T細胞和免疫抑制T細胞之間的平衡,，我們對69例未接受治療的SMM患者的BM進行了流式細胞術(shù)分析,。發(fā)現(xiàn)CD8+ T/Treg比值高的與比值低的患者相比，進展為活動性MM的時間更短(PFS: median progression-free survival) f-g,，表明SMM的快速進展是通過腫瘤細胞阻斷PD-1+CD8+ T淋巴細胞而發(fā)生的,，而與Treg細胞無關(guān)，這表明具有高風險進展的SMM患者可能受益于抗PD-1治療,。接下來,，在新診斷的170例臨床活動性MM患者中研究BM CD8+ T/Treg比值，14%表現(xiàn)出更高T細胞比率與MIcγ1小鼠相似,， 86%低比率患者與BIcγ1小鼠相似h,，那度胺和地塞米松治療后，發(fā)現(xiàn)比值高的患者早期復發(fā)率高i,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，從前體階段發(fā)展到MM的時間塑造了BM免疫微環(huán)境,，這反過來影響了臨床免疫治療的結(jié)果。

6. 調(diào)節(jié)CD8+T/Treg比值提高免疫治療效果

為了探索TME中T細胞亞群之間的功能相互作用,，對小鼠和患者的MGUS期,、MM期、健康對照 的BM CD3+ T淋巴cell進行了 scRNA-seq和TCR-seq a,。在MIcγ1和BIcγ1小鼠中,，CD8+ T細胞在MM期同樣表達了耗竭/激活標記(Pdcd1、Tigit,、Lag3)和細胞毒性標記(Ifng,、Gzma、Gzmb,、Gzmk),，但在MGUS期中幾乎檢測不到這些標記，Treg細胞也表達激活,、免疫抑制狀態(tài)的標記物,，包括Tigit、Ctl4,、Cxcr3,、Tnfrsf9（編碼Cd137）、Icos和Tnfrsf4（OX40）b,。有趣的是,，這種Treg細胞活化的表型在MGUS樣品中已經(jīng)很明顯，并且在兩種模型小鼠的MM階段保持不變c,。scRNA-seq和TCR-seq數(shù)據(jù)表明,，在小鼠模型和患者MGUS期，CD8+ T細胞中發(fā)現(xiàn)了頻繁的克隆型TCR序列（紫色與黃色重疊）,，但Treg沒有d,。

接下來，探討破壞T細胞毒性和免疫抑制之間的平衡是否會影響對ICB的反應,。發(fā)現(xiàn)CD8+ T細胞的耗竭明顯加速MM的發(fā)病,，而體內(nèi)Treg細胞的耗竭則相反，提示CD8+ T細胞和Treg細胞在MM細胞的調(diào)控中起作用e-f,。通過TIGIT抑制緩解CD8+ T細胞衰竭導致對PD-1和PD-L1阻斷的反應,，實現(xiàn)持久的MM反應g。此外,，用CD25單克隆抗體消耗Treg細胞延長了小鼠的生存期,，并增強了抗PD-1和抗PD-L1治療的療效h?？偟膩碚f,，這些數(shù)據(jù)強化了骨髓CD8+ T/Treg細胞比例預測ICB反應性的概念,，并為優(yōu)化臨床MM免疫治療提供了潛在的生物標志物。

本文研究意義：

建立了多發(fā)性骨髓瘤的異質(zhì)性模型,，為疾病的治療研究提供便利

提出了CD8+ T/Treg比值,，作為檢測及評估治療的生物標志物

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