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隨著流式分析,、細(xì)胞分選,、單細(xì)胞組學(xué)、質(zhì)譜流式等研究技術(shù)的蓬勃發(fā)展,，單細(xì)胞也在腫瘤免疫學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等多個領(lǐng)域成為大眾的焦點(diǎn),，它能夠很好地反映細(xì)胞的特異性和異質(zhì)性。目前,，組織（以腫瘤組織為例）制備成單細(xì)胞懸液的方法主要有機(jī)械解離法,、酶解法和化學(xué)法（圖1）。

圖1 腫瘤組織制備成單細(xì)胞懸液的方法[1]

高質(zhì)量的初始樣本是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵,。然而如何在此基礎(chǔ)上,，進(jìn)一步優(yōu)化粗懸液，獲得高質(zhì)量的單細(xì)胞懸液呢,？基于三者的原理以及適用范圍等（表1）,，我們發(fā)現(xiàn)這些方法處理樣本時，沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),。就機(jī)械法來說,，每次實(shí)驗(yàn)研磨的力道稍有不同，對細(xì)胞造成的損傷也不一樣,，這樣就很難保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性,。不僅如此，處理樣本的過程中,，細(xì)胞可能會出現(xiàn)“死亡,、碎片化、粘連"的情況,，甚至某些組織如脾臟,、心臟等還存在“紅細(xì)胞"這一干擾因素。

表1 組織制備單細(xì)胞懸液方法的區(qū)別

針對這些問題,，我們“對癥下藥",，單細(xì)胞懸液質(zhì)量優(yōu)化的神兵利器主要有以下五種：

1、gentleMACS Dissociator：gentleMACS全自動組織溫和處理器可快速,、溫和,、安全、自動,、便捷和標(biāo)準(zhǔn)化地將組織（如脾臟,、肝臟、腫瘤,、表皮等）處理成單細(xì)胞懸液,，可謂是組織樣本處理的絕好幫手。其包含全自動組織解離器,、zhuan利解離管和針對不同組織優(yōu)化的解離試劑盒,，以及預(yù)設(shè)軟件程序在內(nèi)的整體方案，實(shí)現(xiàn)對不同組織樣本的優(yōu)化解離,，確保細(xì)胞的活力,、功能和表面表位的完好。能夠確保每一次解離都在優(yōu)化條件,，同時解放雙手,，結(jié)果也可以輕松重復(fù)。

2,、預(yù)分離：粗懸液中的細(xì)胞團(tuán)塊會導(dǎo)致細(xì)胞的不wan全標(biāo)記或增加非特異性結(jié)合標(biāo)記而分離得到許多非目的細(xì)胞,。不僅如此，在一些后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，細(xì)胞團(tuán)塊也會影響細(xì)胞的最佳狀態(tài),，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,，我們可以在粗懸液制備后對其進(jìn)行預(yù)分離,，利用細(xì)胞濾器或篩網(wǎng)等，去除粗懸液中的細(xì)胞團(tuán)塊,。

3,、死細(xì)胞去除：在二代測序,，細(xì)胞分選等下游實(shí)驗(yàn)中，死細(xì)胞將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和有效性,。死亡的細(xì)胞易裂解導(dǎo)致其中的RNA釋放出來,，會導(dǎo)致檢測的背景噪聲，進(jìn)而影響單細(xì)胞數(shù)據(jù)的質(zhì)量,。此外,，在細(xì)胞分選中，死細(xì)胞會影響捕獲細(xì)胞計數(shù)的準(zhǔn)確性,，不利于下游的細(xì)胞培養(yǎng)和功能驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn),。需要注意的是，當(dāng)細(xì)胞活率<30%時,，不建議進(jìn)行此項(xiàng)操作,，去除死細(xì)胞后，細(xì)胞活率雖然達(dá)到90%以上,，但大部分細(xì)胞都已經(jīng)死亡,，細(xì)胞類型及分群會改變。

圖2 經(jīng)熱休克處理的外周血單核細(xì)胞（PBMC）死細(xì)胞去除前后細(xì)胞分群比較[2]

4,、去除碎片：機(jī)械解離的研磨,，酶解法的吹打，甚至是離心過程,，都可能會產(chǎn)生細(xì)胞碎片,。樣本制備過程中產(chǎn)生的細(xì)胞團(tuán)、細(xì)胞碎片等會增加微流體芯片的堵塞風(fēng)險,，也會增加流式等實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞的非特異性標(biāo)記,。我們可以通過嚴(yán)格控制上述操作的精度和力度來減少細(xì)胞碎片（難度較大），也可以使用細(xì)胞碎片去除試劑盒來優(yōu)化（方便快捷）,。

圖3 成年大鼠心臟組織單細(xì)胞懸液去除碎片前后細(xì)胞群比較[2]

5,、紅細(xì)胞裂解：諸如脾臟、心臟,、肝臟等制備單細(xì)胞懸液都會涉及到紅細(xì)胞的裂解,。紅細(xì)胞過多會導(dǎo)致有效細(xì)胞識別不準(zhǔn)確、有效細(xì)胞-非細(xì)胞界限模糊,、有核率低等問題,。

圖4 成年大鼠心臟組織單細(xì)胞懸液（已去除碎片）進(jìn)行紅細(xì)胞裂解前后比較[2]

相信有了這些法寶，小伙伴們一定能夠獲得高質(zhì)量單細(xì)胞懸液（表2）,，順利開展實(shí)驗(yàn)啦!

表2 高質(zhì)量單細(xì)胞懸液質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

文中相關(guān)產(chǎn)品：

資料來源：

[1] Mitra A, Mishra L, Li S. Technologies for deriving primary tumor cells for use in personalized cancer therapy. Trends Biotechnol. 2013 Jun;31(6):347-54.

[2]美天旎