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2023年2月8日,，俄亥俄州立大學(xué)董一州團隊在Advanced Science發(fā)表了一篇LNP成功遞送saRNA至精母細胞治療小鼠不育的文章——Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice。
 
基因突變引起的男性不育癥是不育癥的重要類型。目前,，臨床上還沒有可靠的方法來解決這種醫(yī)療需求。mRNA療法的出現(xiàn)為修復(fù)生殖系統(tǒng)中的突變基因提供了一種可能的策略,。然而,，將mRNA有效遞送至精母細胞仍然是一項艱巨的挑戰(zhàn),。因此，研究團隊希望開發(fā)一種新的LNP可以將saRNA有效遞送至精母細胞,，用于治療男性不育癥,。

一、CAP LNP的合成,、配方和表征
為了增強mRNA遞送進入精子細胞,，在生物膜和男性生殖系統(tǒng)起到關(guān)鍵作用的一些生物活性分子引起研究人員的關(guān)注。例如,，膽固醇是哺乳動物細胞膜的重要結(jié)構(gòu)成分,，維持細胞膜的完整性和通透性。先前有研究報道在精子生成過程中膽固醇水平會升高,，這表明膽固醇代謝與生育能力之間存在密切關(guān)系,。此外，磷酸基團是磷脂的極性部分,，同時也是是生物膜的關(guān)鍵組成部分,，參與細胞運輸途徑。最后,，氨基可以電離變?yōu)檎娦缘?，與帶負電的mRNA相互作用。除了生物活性之外,，可電離的脂質(zhì)的幾何結(jié)構(gòu),，可以用包封參數(shù)（P值）來描述，會極大地影響 LNPs的傳遞效率,。通常,，P 值大的脂質(zhì)有利于形成倒錐形，有利于內(nèi)體膜的倒六邊形（HII 相）轉(zhuǎn)變和遞送貨物的內(nèi)體逃逸,。
為了實現(xiàn) LNPs 將編碼功能蛋白的 mRNA 遞送進精母細胞中,，恢復(fù)精子生成的目標(biāo)，他們整合了3個生物活性分子單元,，設(shè)計一系列膽固醇-氨基-磷酸酯（CAP）脂質(zhì),，配制成CAP LNPs。CAP LNP 由CAP,、DOPE,、DMG-PEG和編碼Dmc1的mRNA配制而成。在顯微注射到曲細精管后,，CAP LNP將Dmc1 mRNA遞送到精母細胞,，從而恢復(fù)染色體重組和精子發(fā)生。

 
圖1 使用CAP LNP遞送編碼Dmc1的 mRNA 的示意圖

首先，研究團隊構(gòu)建了一條 CAP 衍生物的合成路線（圖 2a）,，并進一步表征了它們的理化性質(zhì),，最終選擇了CAP2-4 LNPs進行后續(xù)研究。研究者應(yīng)用 CAP2-4 LNP 在Dmc1 -/-小鼠模型中遞送綠色熒光蛋白(GFP) mRNA,，24小時后分析 GFP 的表達,。如圖 2e所示，CAP2-4 LNPs 在曲細精管周圍誘導(dǎo)出明顯的綠色熒光,，而 MC3 LNPs 和 ALC-0315 LNPs 組中幾乎檢測不到 GFP 信號,。這些結(jié)果證明 CAP2-4 LNPs 是精母細胞中 mRNA 遞送的優(yōu)良載體，遞送效率明顯高于 MC3 和 ALC-0315 LNPs,。

 
圖2 CAP 脂質(zhì)的合成方法,、3D結(jié)構(gòu)以及在生精小管中的遞送效率比較

二、CAP LNP可將saRNA遞送至Dmc1-/-小鼠模型中的精母細胞
接下來,，作者比較了傳統(tǒng) mRNA和saRNA 之間 Dmc1 蛋白的表達時程,。他們將帶有 Flag 標(biāo)簽的 Dmc1 mRNA 或 saRNA 封裝到CAP2-4 LNP 中，并將兩種制劑注射到 Dmc1-/-小鼠的曲細精管中,。給藥后24和72小時,，通過免疫熒光染色評估曲細精管中 Dmc1 的表達。如圖3a所示,，在CAP2-4 LNP-mRNA和CAP2-4 LNP-saRNA 處理的小鼠中24小時均觀察到明顯的 Dmc1 表達,，但在未處理的小鼠中則沒有。CAP2-4 LNP-mRNA給藥72小時后,，曲細精管中幾乎沒有熒光信號（圖3b）,。相反，CAP2-4 LNP-saRNA處理組仍然顯示出強烈的熒光信號（圖3b）,。這些結(jié)果表明,，通過 CAP2-4 LNP 遞送 saRNA 可以維持 Dmc1 蛋白表達至少三天。

圖3 在 Dmc1-/-小鼠中遞送編碼 Dmc1蛋白的傳統(tǒng)mRNA或saRNA

三,、使用CAP LNP遞送saRNA恢復(fù)Dmc1蛋白功能
隨后,，作者通過分析聯(lián)會復(fù)合體 (SC)來檢查 Dmc1 蛋白的功能。SC 是在減數(shù)分裂 I 期間形成的特定結(jié)構(gòu),，負責(zé)同源染色體的聯(lián)會,。由于 Dmc1 缺陷可破壞 SC 形成并阻止減數(shù)分裂 I 后期的精子發(fā)生，因此 SC 被認為是 Dmc1 蛋白功能恢復(fù)的關(guān)鍵指標(biāo),。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理,，處理后第 4天，收集睪丸,。通過 SYCP1 和 SYCP3（參與 SC 形成的兩個主要成分）的免疫熒光染色檢查精母細胞中的 SC,。如圖4a所示, SYCP3和SYCP1染色清楚地顯示了 WT 小鼠的五個亞階段的特征模式,，包括細線期、偶線期,、粗線期、雙線期,、終變期,。在CAP2-4 LNP-saRNA 處理組中，我們觀察到處于粗線期的SC,，這表明同源染色體聯(lián)會的恢復(fù),。此外，對SC在雙線期和終變期的觀察進一步證實了SC可以解體并轉(zhuǎn)運到中期（圖4b）,。相反,，來自 Dmc1-/-小鼠的 SC 在前期的早期階段被阻滯，并且未觀察到粗線期,、雙線期和終變期的 SC（圖4c）,。如圖4d所示，在 CAP2-4 LNP-saRNA 處理后,，粗線期,、雙線期和終變期精母細胞的百分比分別增加到 11%、6% 和 2%,?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明使用 CAP LNP 遞送 saRNA 可恢復(fù)精母細胞中 Dmc1 蛋白的功能,。

 
圖4 使用CAP LNP遞送saRNA可恢復(fù)Dmc1-/-小鼠中的Dmc1功能

四,、CAP LNP-saRNA 挽救 Dmc1-/-小鼠的精子發(fā)生
最后，作者研究了通過 CAP2-4 LNP-saRNA 恢復(fù) Dmc1 蛋白是否可以挽救 Dmc1-/-小鼠的不育癥,。Dmc1-/-小鼠用 CAP2-4 LNP-saRNA 處理,。處理后第10天，收集睪丸和附睪,。睪丸和附睪切片用花生凝集素 (PNA)染色,，它可以特異性結(jié)合精子細胞頂體（圖5a）。PNA 染色的精子細胞位于 WT 小鼠的曲細精管和附睪管中,。然而,，Dmc1-/-小鼠的睪丸和附睪中沒有細胞被 PNA-凝集素染色，表明精子細胞生產(chǎn)全喪失,。相比之下,，我們在 CAP2-4 LNP-saRNA 治療組的曲細精管和附睪管中觀察到了 PNA染色的細胞，這是挽救 Dmc1-/- 小鼠不育表型的直接證據(jù),。統(tǒng)計分析顯示,，治療組每根小管的PNA陽性細胞數(shù)明顯高于未治療組,，達到WT組的二分之一左右（圖5b）。因此,，這些結(jié)果證明,，使用 CAP LNP 遞送 saRNA可以有效挽救 Dmc1-/-小鼠中的精子細胞產(chǎn)生。
此外,，對睪丸樣本進行組織學(xué)分析以評估生精發(fā)育,。如圖5c所示，WT 小鼠表現(xiàn)出正常的睪丸形態(tài),，而 Dmc1-/-小鼠在精母細胞階段表現(xiàn)出精子發(fā)生停滯并且缺乏減數(shù)分裂后細胞,。與 WT 小鼠相比，Dmc1-/-小鼠的生發(fā)層厚度和生精管直徑顯著降低（圖5d,，e）,。相比之下，CAP2-4 LNP-saRNA 重建了 Dmc1-/-小鼠的睪丸形態(tài),，增加了生發(fā)層厚度和生精管直徑（圖5d,，e)。精子懸液細胞學(xué)涂片顯示,，CAP2-4 LNP-saRNA處理組的附睪產(chǎn)生橢圓頭單尾不卷曲的精子,，而未處理組未觀察到精子樣細胞（圖 5f）。

 
圖5 使用 CAP LNP 遞送saRNA可挽救 Dmc1 -/-小鼠的不育表型

總的來說,，這項研究利用 CAP LNPs 可以向精母細胞傳遞 mRNA,，證明基于mRNA療法在治療由基因突變引起的男性生殖疾病方面的可行性。

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參考文獻：
【1】 Du S, Li W, Zhang Y, et al. Cholesterol-Amino-Phosphate (CAP) Derived Lipid Nanoparticles for Delivery of Self-Amplifying RNA and Restoration of Spermatogenesis in Infertile Mice. Adv Sci (Weinh). 2023 Feb 7:e2300188.