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本文涉及應(yīng)用技術(shù)：均相時間分辨熒光（HTRF&TR-FRET）。來看研究人員是如何利用HTRF技術(shù)助推心血管疾病的研究的吧,。
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一氧化氮信號通路研究
一氧化氮（NO）是自分泌和旁分泌的信號通路分子,，可以擴散進入生物膜。發(fā)揮作用時間很短，促進血管動態(tài)平衡,。能夠抑制平滑肌收縮生長,，阻止血小板凝聚以及防止白細胞-內(nèi)皮細胞粘附。另外它還參與免疫防御系統(tǒng),，神經(jīng)傳遞,，血管生成等過程。研究表明,，這種配體/受體長期低表達可能是高血壓,、心力衰竭、心肌梗死,、中風(fēng)和死亡的發(fā)病的關(guān)鍵,。因此，NO-sGC信號通路廣泛用于可恢復(fù)功能缺陷的治療藥物的研究,。

2011年,，Ramanathan等人在研究新發(fā)現(xiàn)的sCG抑制劑血栓反應(yīng)蛋白-1(TH-1)，這是一種與多種膜受體(包括CD47)結(jié)合的多結(jié)構(gòu)域蛋白,。他們對活細胞和細胞裂解物進行了HTRF cGMP檢測,，以評估在NO存在的情況下，各種情況對sGC活性的影響,。結(jié)果表明,，TH-1的E3CaG1片段與CD47結(jié)合時，抑制NO-sGC信號(圖2.A),。在E3CaG1存在下,，加入CD47抗體，NO-sGC信號增強(圖2.B),。此外,，E3CaG1與CD47結(jié)合引起細胞內(nèi)鈣離子增加，cGMP減少(圖2.C),。

藥物的發(fā)現(xiàn)
2018年,，Tobin等人研究IW-1973，一種新開發(fā)的sGC激動劑,。作者通過HTRF技術(shù)檢測cGMP,、總VASP和磷酸化VASP（Ser 239）來檢測其功能。結(jié)果表明,，在30mM NO條件下,，IW-1973激活sGC，EC50為267 nM,。對cGMP的影響很低,，對VASP磷酸化的影響達到峰值為78%,。

藥物的高通量篩選
高甘油三酯水平與心血管疾病的患病風(fēng)險相關(guān)。載脂蛋白CIII(ApoC-III)（在脂解和脂質(zhì)合成中的作用）是它們的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子和治療應(yīng)用的合理靶點之一,。

2017年,，Jun Lee和Mahankali等人旨在識別可能顯示出治療效果的ApoC-III的小分子抑制劑。使用HTRF ApoC-III檢測,，他們篩選了超過95萬種化合物,，并確定了抑制率高于50%的化合物，并對其進行了進一步的研究（圖4）,。

結(jié)果顯示,，反式維甲酸(atRA)可能是有效的抑制劑。被認為是與兩個受體家族相關(guān)(RARs和RXRs),，作者進一步使用HTRF載脂蛋白分析來確定atRA對ApoC-III的影響僅是通過RARs介導(dǎo)的,。

總的來說，對ApoC-III分泌的各種RAR受體激動劑進行了研究,。AM580有效的減少ApoC-III分泌,，有效改善高脂飲食小鼠的體重、肝臟狀況,、心臟狀況和甘油三酯水平。這些研究表明,，一種RARα特異性激動劑可能為降脂和降低CVD風(fēng)險提供了一種新的策略,。

表征配體的功能研究--新開發(fā)抗β-Arestin受體配體
β-Arestin是一種多功能信號蛋白，主要作用于GPCR脫敏,，通過β-1-腎上腺素能受體激活EGFR/ERK信號,，已被認為在心力衰竭模型中具有心臟保護作用。

為了更好地和直接觀察表達β-Arestin受體（βAR）的細胞和組織的生理和病理功能,，Mitronova等人（2017）開發(fā)此類受體的熒光配體,。用熒光基團標(biāo)記已知的βAR拮抗劑卡唑洛爾和激動劑BI-167107，米特羅諾娃的團隊進行了配體-受體結(jié)合實驗和生物活性的分析,。HTRF Tag-lite β1AR或 β2AR分析來確定解離常數(shù)（Kd）,，通過檢測cAMP分析評估新配體的效力。

結(jié)語：該文章提供了HTRF技術(shù)在心血管相關(guān)研究的中的相關(guān)思路并得到驗證的數(shù)據(jù),。為心血管疾病研究的道路“開辟捷徑",，主要研究思路包括：
①候選藥物的藥理特性分析；
②對潛在分子的化合物進行高通量篩選：HTRF高通量篩選平臺,；
③受體-配體相互作用的研究：HTRF Tag-lite（基于細胞膜受體-配體）,；
④深入研究信號通路：磷酸化蛋白和總蛋白檢測，生物標(biāo)志物檢測,。

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