a. 色譜柱接頭和系統(tǒng)管路注意事項所需工具：

3/8英寸扳手

5/16英寸扳手

小心拿取色譜柱。切勿讓色譜柱掉落或撞擊到堅硬表面,，因為這樣會擾亂柱床并且影響色譜柱性能,。

1. 正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對于獲得高質(zhì)量色譜結(jié)果至關(guān)重要。

2. 使用標準不銹鋼壓力螺母接頭時,，確保其正確匹配1/16英寸外徑不銹鋼管路非常重要,。擰緊或擰松壓力螺母時,，將5/16英寸扳手置于壓力螺母上，并將3/8英寸扳手置于色譜柱末端接頭的六角頭上,。

  注：在這個過程中,，如果將任一扳手放在色譜柱管路的搭扳手平面上，會導(dǎo)致末端接頭松動滲漏,。

3. 如果在不銹鋼壓力螺母接頭和色譜柱末端接頭之間出現(xiàn)滲漏,，則必須組裝新的壓力螺母接頭、管路和錐箍,。

4. 色譜柱識別標簽上的箭頭指示了正確的溶劑流向,。

  正確連接接入和接出色譜柱的1/16英寸外徑不銹鋼管路對于獲得高質(zhì)量色譜結(jié)果至關(guān)重要。管路應(yīng)接觸到色譜柱末端接頭的底部,，二者之間不應(yīng)有死體積。本應(yīng)成功的分離可能因色譜柱發(fā)生額外峰展寬而失敗,，認識到這一點非常重要,。下文詳細介紹了如何選擇合適的色譜柱接頭和系統(tǒng)管路。

  由于缺乏行業(yè)標準,，不同色譜柱制造商使用了不同類型的色譜柱接頭,。如果色譜柱末端接頭的類型與現(xiàn)有的管路接頭設(shè)置不匹配，可能對色譜分離性能產(chǎn)生負面影響,。下文將解釋沃特世和Parker的錐箍及末端接頭之間的差別（圖1）,。不同類型的末端接頭要求管路伸出錐箍的長度不盡相同。Symmetry色譜柱配備的沃特世末端接頭要求管路伸出錐箍0.130英寸,。如果您目前使用的不是沃特世色譜柱,，則在安裝Symmetry色譜柱前必須重置錐箍深度以獲得理想性能。

  管路/色譜柱連接正確時（圖2）,，管路應(yīng)接觸到色譜柱末端接頭的底部,，二者之間不應(yīng)有死體積。

  流路中存在死體積會影響色譜柱性能,。如果將Parker錐箍連接至沃特世末端接頭,，就可能出現(xiàn)這種情況（圖3）。

注：如果將裝有Parker錐箍的管路連接到沃特世色譜柱上,，會出現(xiàn)死體積,。

  只有一種方法可以解決這個問題：切斷裝有錐箍的管路末端，在管路上安裝新的錐箍并重新連接,。在擰緊螺母前,，請確保管路接觸到色譜柱末端接頭的底部。

  相反,，如果是將裝有沃特世錐箍的管路連接到帶Parker末端接頭的色譜柱,，則管路末端在錐箍到達合適的密封位置之前就會接觸到底部,。

這會留下空隙并造成滲漏（圖4）。

有兩種方法可以解決這個問題：

1. 進一步擰緊螺母,。這樣錐箍會向前移動并到達密封表面,。切勿過度擰緊，因為這樣可能會損壞螺母,。

2. 切斷管路,，更換錐箍并重新連接?；蛘?，用可重置錐箍深度的一體化PEEK™接頭（P/N：

PSL613315）替換常規(guī)壓力螺母接頭。

b．盡可能減少譜帶展寬

  圖5顯示了管路內(nèi)徑對系統(tǒng)譜帶展寬以及峰形的影響,。由圖可見,，管路內(nèi)徑較大會引起峰展寬和靈敏度降低。

c. 安裝卡套柱

  參見圖6所示的安裝說明,。擰松舊卡套柱上的末端接頭,，使其與儀器入口和出口管路保持連接。

將新的卡套柱連接到接頭之間,，使標簽上的液流流向箭頭指向檢測器,。用手擰緊所有接頭。

d. 測量系統(tǒng)譜帶展寬體積

該測試應(yīng)在配備UV檢測器的HPLC系統(tǒng)上進行,。

1. 從系統(tǒng)中取下色譜柱,，換上一個零死體積兩通。

2. 將流速設(shè)置為1 mL/min,。

3. 以流動相稀釋測試混合物,，使檢測器的靈敏度達到0.5~1.0 AUFS（可使用含有尿嘧啶、羥苯乙酯和羥苯丙酯的系統(tǒng)啟動測試混合物,；P/N: WAT034544）,。

4. 進樣此溶液2-5μL。

5. 測量4.4%峰高處的峰寬（5-sigma法）：

——5-sigma譜帶展寬(?L) =

峰寬(min)×流速(mL/min)×(1000μL/1 mL)

——系統(tǒng)方差(μL²) =

(5-sigma譜帶展寬)²/25

  對于典型HPLC系統(tǒng),，譜帶展寬體積不應(yīng)大于100μL±30μL（或方差400μL²±36μL²）,。

  對于微內(nèi)徑（2.1 mm內(nèi)徑）系統(tǒng)，譜帶展寬體積不應(yīng)大于20~40μL（或方差不應(yīng)大于160μL²~640μL²）,。

e. 測量系統(tǒng)體積

  系統(tǒng)體積對于放大分離非常重要,，因為它會在每次運行開始時產(chǎn)生一段等度保持。在小規(guī)模分離中,，這段等度保持通常是數(shù)倍色譜柱體積,，但對于制備型分離，等度保持可能只占制備級色譜柱體積的一部分,。設(shè)計放大實驗時必須考慮補償該體積,，以避免色譜峰畸變（圖8）,。

1. 取下色譜柱。

2. 使用乙腈作為流動相A,，含0.05 mg/mL尿嘧啶的乙腈作為流動相B（消除無添加劑混合和粘度問題）,。

3. 將UV檢測器波長設(shè)置為254 nm。

4. 在目標儀器上運行初始方法中的流速和預(yù)期流速,。

5. 采集運行100%流動相A時的基線5 min,。

6. 將梯級設(shè)置為5 min后變?yōu)?/span>100%流動相B，然后繼續(xù)采集數(shù)據(jù)5 min,。

7. 測量100%流動相A和100%流動相B之間的吸光度差值,。

8. 測定該吸光度差值的50%處的時間。

9. 計算梯度起點與50%點之間的時間差值,。

10. 將時間差值乘以流速,。