一.直接免疫熒光法測抗原

　　基本原理
　　將熒光素標記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點是方法簡便,、特異性高,，非特異性熒光染色少,，相對使用標記抗體用量偏大,。

　　試劑與儀器
　　磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L,，pH7.4
　　熒光標記的抗體溶液：以0.01mol/L，pH7.4的PBS進行稀釋
　　緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制
　　搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L,，pH7.4的PBS1500ml）
　　有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
　　熒光顯微鏡
　　玻片架
　　濾紙
　　37℃溫箱等,。

　　實驗步驟
　　1.滴加0.01mol/L，pH7.4的PBS于待檢標本片上,，10min后棄去,，使標本保持一定濕度。
　　2.滴加適當稀釋的熒光標記的抗體溶液,，使其*覆蓋標本,，置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，保溫一30min定時間（參考：30min）,。
　　3.取出玻片,，置玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗后,，再按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸3-5min,，不時振蕩。
　　4.取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標本干燥，加一滴緩沖甘油,，以蓋玻片覆蓋,。
　　5.立即用熒光顯微鏡觀察,。觀察標本的特異性熒光強度，一般可用“+”表示：（-）無熒光,；（±）極弱的可疑熒光,；（+）熒光較弱，但清楚可見,；（++）熒光明亮,；（+++--++++）熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上,，而各種對照顯示為（±）或（-）,，即可判定為陽性。

　　注意事項
　　1.對熒光標記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋在1：20-100之間，要自行摸索*梯度,，建立的稀釋比例,，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結(jié)果的觀察,。
　　2.染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。
　　3.為了保證熒光染色的正確性,，試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。
　?。?）標本自發(fā)熒光對照：標本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS,。
　　（2）特異性對照（抑制試驗）：標本加未標記的特異性抗體,，再加熒光標記的特異性抗體,。如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，待檢標本呈強熒光,，則為特異性陽性染色,。
　　4.一般標本在高壓*燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標本在當天觀察,，隨著時間的延長,，熒光強度會逐漸下降。

　　二.間接免疫熒光法測抗原

　　基本原理
　　染色程序分為兩步,，*步,，用已知未標記的抗體（待檢標本）加到已知抗原（待檢標本）標本上，在濕盒中37℃保溫30min,，使抗原抗體充分結(jié)合,，然后洗滌，除去未結(jié)合的抗體,。
　　第二步,，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體（通常為熒光標記的對應(yīng)二抗）,。如果*步發(fā)生了抗原抗體反應(yīng),，標記的熒光標記的二抗就會和已結(jié)合抗原的抗體進一步結(jié)合，從而可鑒定被檢測抗原,。

　　試劑與儀器
　　磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）：0.01mol/L,，pH7.4
　　緩沖甘油：分析純無熒光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。
　　熒光標記的抗人球蛋白抗體：以0.01mol/L,，pH7.4的PBS進行稀釋,。
　　搪瓷桶三只（內(nèi)有0.01mol/L，pH7.4的PBS1500ml）
　　有蓋搪瓷盒一只（內(nèi)鋪一層浸濕的紗布墊）
　　熒光顯微鏡
　　玻片架
　　濾紙
　　37℃溫箱等,。

　　實驗步驟
　　1.滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于未知抗原標本片，10min后棄去,，使標本片保持一定濕度,。
　　2.滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當稀釋抗體,，覆蓋未知抗原標本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。
　　3.取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時振蕩,。
　　4.取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，但不使標本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記二抗
　　5.將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。
　　6.重復(fù)操作3,。
　　7.取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片。
　　8.熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法,。
　　注意事項
　　1.熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4℃保存4h,，時間過長,，會使熒光減弱。
　　2.每次試驗時,，需設(shè)置以下兩種對照：
　?。?）陰性對照：陰性血清+熒光標記物（需有使用人員自行建立標準）
　　（2）熒光標記物對照：PBS+熒光標記物如果標本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光,，待檢標本呈強熒光,，則為特異性陽性染色。
　　3.未知抗原標本片需在操作的各個步驟中,，始終保持濕潤,，避免干燥。
　　4.所滴加的抗體或熒光標記物,，應(yīng)始終保持在未知抗原標本片上,，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色,。