蛋白質(zhì)印跡的實(shí)驗(yàn)原理,、方法與步驟

實(shí)驗(yàn)原理

Western Blot（蛋白質(zhì)印跡或免疫印跡）技術(shù),，以蛋白質(zhì)為檢測(cè)對(duì)象，“探針”是抗體,，“顯色”用標(biāo)記的二抗,。實(shí)驗(yàn)采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將樣品蛋白質(zhì)分離，再轉(zhuǎn)移到固相載體（PVDF尼龍膜或NC膜）上,；固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變；然后以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原,，與其對(duì)應(yīng)的抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng),，特異性一抗再與和酶耦聯(lián)的第二抗體反應(yīng)，zui后在酶的作用下,，導(dǎo)致底物顯色或化學(xué)發(fā)光顯影,，來檢測(cè)電泳分離的特異性目的靶蛋白。

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳分辨力高和固相免疫測(cè)定特異性高,、敏感等諸多優(yōu)點(diǎn),，能從復(fù)雜混合物中對(duì)特定抗原進(jìn)行鑒別和定量檢測(cè)。 

實(shí)驗(yàn)試劑

1. SDS-PAGE試劑,。

2. 勻漿緩沖液：1.0mol/L Tris-HCl(pH6.8)1.0ml,；10%SDS 6.0ml,；β-巰基乙醇 0.2ml；ddH₂O 2.8ml,。

3. 固相載體：PVDF尼龍膜或NC膜（硝酸纖維素薄膜）,。

4. 轉(zhuǎn)膜緩沖液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g,；SDS 0.37g,；甲醇200ml；加ddH₂O定容至1000ml (48mmol/L Tris.HCl,，39mmol/L甘氨酸,，0.037％ SDS)。

5. PBS-T(pH7.4)： 0.01mol/L PBS（NaCl 8.0g,；KCl 0.2g,；Na₂HPO₄ 1.44g；KH₂PO₄0.24g）,；1g吐溫20,，加ddH₂O至1000ml。

6. 膜染色液：考馬斯亮藍(lán) 0.2g,；甲醇80ml,；乙酸2ml；ddH₂O 118ml,。

7. 封閉液（5%脫脂奶粉,，現(xiàn)配）：脫脂奶粉1.0g 溶于20ml的0.01mol/L PBS中。

8. 顯色液：化學(xué)發(fā)光劑（ECL）或DAB 6.0mg,，0.01mol/L PBS 10.0ml,，硫酸鎳胺0.1ml；H₂O₂ 1.0μl,。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備

1. 電泳儀

2. 搖床等

實(shí)驗(yàn)材料

待測(cè)蛋白質(zhì)或基因表達(dá)產(chǎn)物,。

實(shí)驗(yàn)步驟

1. 蛋白質(zhì)樣品的制備與SDS-PAGE分離

   １) 蛋白質(zhì)樣品獲得　

      a. 細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，樣品一般直接用SDS凝膠加樣緩沖液裂解,；

      b. 哺乳動(dòng)物組織通?？蓹C(jī)械分散（機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5～1min）并直接溶于SDS凝膠加樣緩沖液，然后4℃,，13 000g離心15min,，取上清液作為樣品；

      c. 組織培養(yǎng)的單層細(xì)胞可用勻漿緩沖液裂解,，也可直接在SDS凝膠加樣緩沖液中裂解,；制備好的樣品用做SDS- PAGE分析。

   ２) 電泳　按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE。

2. 蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到NC膜上（半干式轉(zhuǎn)移）

   １) 平衡凝膠：用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡,，5min×3次,。

   ２) 膜處理: 將濾紙和NC膜，一同在轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10min,。

   ３) 轉(zhuǎn)膜：

      a. 轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板,、3層厚濾紙、PVDF尼龍膜,、凝膠,、3層厚濾紙、陰極碳板的順序放好,，濾紙,、凝膠、PVDF尼龍膜對(duì)齊,，每一步去除氣泡,，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干,。

      b. 用支架夾緊上述各層,，置電轉(zhuǎn)移槽中，NC膜一側(cè)靠正極,，凝膠一側(cè)靠負(fù)極,。接通電源，40V,、約1.轉(zhuǎn)移1.5～6h。轉(zhuǎn)移時(shí)間長短依靶蛋白分子量大小來調(diào)節(jié),。

      c. 轉(zhuǎn)移結(jié)束后,，斷開電源將膜取出，割取待測(cè)膜條做免疫印跡,。

      d. 將有蛋白Marker的條帶染色,，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脫色,，至背景清晰,，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存,，留與顯色結(jié)果作對(duì)比,。

3. 免疫探測(cè)　包括被轉(zhuǎn)印到膜上的靶抗原與*抗體（特異抗體）反應(yīng)、與酶標(biāo)第二抗體 (抗抗體) 反應(yīng),，以及用酶相應(yīng)的底物處理后進(jìn)行靶蛋白（抗原）信號(hào)檢測(cè),。

   1) 用0.01mol/L PBS洗膜，5min×3次。

   2) 加入封閉液（5％脫脂奶粉或2％牛血清白蛋白）,，浸泡被轉(zhuǎn)印膜,，室溫或37℃（平緩搖動(dòng)）反應(yīng)1～3h，以封閉轉(zhuǎn)印膜上一些非特異性蛋白質(zhì)的潛在結(jié)合位點(diǎn),，避免非特異性反應(yīng),。

   3) 棄封閉液，用0.01mol/L PBS洗膜,，5min×3次,，振蕩。

   4) 將封閉好的轉(zhuǎn)印膜浸入*抗體溶液（按合適稀釋比例,，用1/2量0.01mol/L PBS加1/2量封閉液稀釋）中,，抗體液用量約0.2ml/cm²，37℃反應(yīng)1～2h或4℃反應(yīng)12h以上,，保持平緩搖動(dòng),。陰性對(duì)照，以1%BSA取代一抗,，其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同,。

   5) 棄一抗，用0.01mol/L PBS分別洗膜,，10min×3次,，振蕩。

   6) 加入辣根過氧化物酶（HP）偶聯(lián)的二抗溶液［稀釋方法同（4）］,，室溫下反應(yīng)1～2h,，保持平緩搖動(dòng)。

   7) 棄二抗,，用0.01mol/L PBS洗膜,，10min×4次，振蕩,。

4. 靶蛋白（抗原）檢測(cè) 

   1) 化學(xué)發(fā)光劑（ECL）檢測(cè)轉(zhuǎn)印膜上靶蛋白信號(hào)（近年多用）,，具體操作按ECL說明書進(jìn)行，然后于暗室中用膜對(duì)X光片曝光,，將所得Ｘ光片上的信號(hào)條帶進(jìn)行灰度掃描,，計(jì)算其積分光密度值。新問世的“化學(xué)發(fā)光數(shù)字成像分析儀”已將曝光,、掃描與光密度分析集于一體,，既減少信號(hào)損失，又方便結(jié)果保存,，還節(jié)省膠片,。

   2) 顯色反應(yīng)檢測(cè)轉(zhuǎn)印膜上靶蛋白信號(hào)（以往常用），將膜放入相應(yīng)顯色劑（DAB）中，避光顯色至出現(xiàn)條帶時(shí)放入雙蒸水中終止反應(yīng),。陽性反應(yīng)將在靶蛋白相對(duì)應(yīng)的位置上出現(xiàn)有顏色的條帶,。

檢測(cè)完畢后，將NC膜浸泡于洗脫液（100mmol/L-ME,， 20g/L SDS,，62.5mmol/L Tris-HCl，pH6.7）中,，50℃,，振蕩30min，以去除膜上抗體,，供再次檢測(cè)用,。

注意事項(xiàng)

1. 一抗的選擇是影響免疫印跡成敗的主要因素。多克隆抗體結(jié)合抗原能力較強(qiáng),、靈敏度高,，但易產(chǎn)生非特異性的背景；單克隆抗體識(shí)別抗原特異性較好,，但可能不識(shí)別在樣品制備時(shí)因變性而失去了空間構(gòu)型的抗原表位,，且易發(fā)生交叉反應(yīng)。因此,，兼有多克隆抗體和單克隆抗體優(yōu)點(diǎn)的混合單克隆抗體近年特別被推薦,，它是由一組能與抗原分子中的不同且不易變性的抗原表位結(jié)合并不易出現(xiàn)交叉反應(yīng)的單克隆抗體混合構(gòu)成。

2. 如果反應(yīng)靈敏度不高,，可增加凝膠的厚度到1.5mm（厚度超過2.0mm時(shí),，凝膠轉(zhuǎn)移效率受限）；也可在電泳條帶不發(fā)生變形的前提下,，盡量提高蛋白樣品的上樣量,。

3. 濾紙/凝膠/轉(zhuǎn)印膜/濾紙夾層組合中不能存在氣泡，可用玻璃棒在夾層組合上滾動(dòng)將氣泡趕出,，以提高轉(zhuǎn)膜效率；上下兩層濾紙不能過大,，避免導(dǎo)致直接接觸而引起短路,。

4. 如果出現(xiàn)非特異性的高背景，可觀察僅用二抗單獨(dú)處理轉(zhuǎn)印膜所產(chǎn)生的背景強(qiáng)度,，若高背景確由二抗產(chǎn)生,，可適當(dāng)降低二抗?jié)舛然蚩s短二抗孵育時(shí)間；并考慮延長每一步的清洗時(shí)間,。

5. 一抗與二抗的稀釋度,、作用時(shí)間和溫度對(duì)檢測(cè)不同的蛋白要求不同，須經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定*條件。

6. 一般情況使用0.45μm的NC膜,，0.1～0.2μm的小孔徑膜只適合于分子量小于20kD的蛋白質(zhì),。

7. PVDF尼龍膜較NC膜柔軟、結(jié)實(shí),、靈敏度高,，易于操作且蛋白質(zhì)結(jié)合能力強(qiáng)（PVDF膜可結(jié)合蛋白質(zhì)480μg/cm²，而NC膜只能結(jié)合蛋白質(zhì)80μg /cm²）,；缺點(diǎn)是PVDF尼龍膜背景也高,，需要加強(qiáng)封閉；此外,，PVDF尼龍膜若在使用前先行甲醇處理5～10s,，以活化膜表面的正電基團(tuán)，使它更容易與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,，可提高蛋白質(zhì)在膜上的保留指數(shù),。

8. 使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)，試劑須按需要量臨用前配置混合,。