流式細(xì)胞技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法

PI 染色操作步驟

1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min，棄上清液,。

2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清,。

3,、加入2ml預(yù)冷的70%酒精，4℃固定30min,，或是-20℃固定過夜,。

4、離心,，棄上清液,。

5、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心,。

6、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,，37℃孵育30min,，離心。

7,、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心。

8,、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,，室溫避光孵育30min。

9,、混勻,，過300目篩網(wǎng),，置流式管中， 4℃冰箱保存,，待測,。

GFP PI染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500rpm , 5min，棄上清液,。

2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次，棄上清,。

3,、加入2ml預(yù)冷PFA，PFA的濃度根據(jù)細(xì)胞的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié),，4℃固定30min,。 以下步驟同PI 染色操作步驟的（4-9）

細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500rpm , 5min，棄上清液,。

2,、以冷PBA 1ml，離心洗滌,，棄上清液,。

3、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,。用微量移液器輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min-1h。

4,、離心棄上清液,。

5、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分,。

6、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中,，4℃避光保存，待測,。

細(xì)胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

1-2,、同細(xì)胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

3,、 用PBA稀釋的*抗體200ul，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG,，輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育1、5-2h,。離心,，棄上清。

4,、 PBS 1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

5,、 PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200ul,。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min,，避光,。

6、 PBS 1ml離心洗滌2次,。

7、將細(xì)胞重新懸浮于500ulPBS中,，混勻,，置流式管中，避光,，4℃冰箱保存,，待測。

胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

1,、將單細(xì)胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心，1500 rpm , 5 min,，棄上清液,。

2、用1×PBS 1 ml洗滌1次,，離心,。

3、4% PFA 1ml,，4 ℃固定30min,。

4、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心,。

5,、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min。

6,、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心。

7,、加入用PBA稀釋的熒光素標(biāo)記的抗體200ul,，用微量移液器輕輕吹打混勻，4℃或置冰上孵育30 min-1h,。

8,、離心棄上清液。

9,、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

10,、向細(xì)胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中，4℃避光保存,，待測,。

胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟

1-6、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

7,、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul,，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實(shí)驗(yàn)動(dòng)物IgG，輕輕吹打混勻,，4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h,。離心，棄上清,。

8,、冷PBS 1ml離心洗滌1次，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體,。

9,、加入PBA適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記的第二抗體200 ul。吹打混勻,，4 ℃或置冰上孵育30 min,，避光。

10,、冷PBA 1ml離心洗滌2次,。

11、將細(xì)胞重新懸浮于500 ul PBS中，混勻,，置流式管中,，避光，4 ℃冰箱保存,，待測,。
備注：

1、 RNase A： 貯液濃度：1mg/ml ,；

工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 20ug/ml。

2,、PI： 貯液濃度：2.5mg/ml,；

工作液配制： 加2、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 50ug/ml,。

3、PBA ： 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,，加0.1%疊氮鈉,。

4、檢測樣品細(xì)胞濃度1x10 /ml,。