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流式細胞技術(shù)實驗方法
PI 染色操作步驟
1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,,1500rpm , 5min,,棄上清液。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,,棄上清。
3,、加入2ml預(yù)冷的70%酒精,,4℃固定30min,或是-20℃固定過夜,。
4,、離心,棄上清液,。
5,、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心,。
6,、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中,37℃孵育30min,,離心,。
7,、用1×PBS 1ml洗滌1次,離心,。
8,、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中,室溫避光孵育30min,。
9,、混勻,過300目篩網(wǎng),,置流式管中,, 4℃冰箱保存,待測,。
GFP PI染色操作步驟
1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,,1500rpm , 5min,,棄上清液。
2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,,棄上清。
3,、加入2ml預(yù)冷PFA,,PFA的濃度根據(jù)細胞的特點進行調(diào)節(jié),4℃固定30min,。 以下步驟同PI 染色操作步驟的(4-9)
細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,離心,,1500rpm , 5min,,棄上清液。
2,、以冷PBA 1ml,,離心洗滌,棄上清液,。
3,、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻,,4℃或置冰上孵育30min-1h,。
4、離心棄上清液。
5,、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,,以除去未結(jié)合的多余抗體成分。
6,、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,,置流式管中,4℃避光保存,,待測,。
細胞表面間接免疫熒光染色操作步驟
1-2、同細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟
3,、 用PBA稀釋的*抗體200ul,,對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG,輕輕吹打混勻,,4℃或置冰上孵育1,、5-2h。離心,,棄上清,。
4,、 PBS 1ml離心洗滌1次,,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。
5,、 PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul,。吹打混勻,4℃或置冰上孵育30min,,避光,。
6、 PBS 1ml離心洗滌2次,。
7,、將細胞重新懸浮于500ulPBS中,混勻,,置流式管中,,避光,4℃冰箱保存,,待測,。
胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,,離心,,1500 rpm , 5 min,棄上清液。
2,、用1×PBS 1 ml洗滌1次,,離心。
3,、4% PFA 1ml,,4 ℃固定30min。
4,、用1×PBS 1ml洗滌1次,,離心。
5,、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min,。
6、用1×PBS 1ml洗滌1次,,離心,。
7、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul,,用微量移液器輕輕吹打混勻,,4℃或置冰上孵育30 min-1h。
8,、離心棄上清液,。
9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,,以除去未結(jié)合的多余抗體成分,。
10、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,,置流式管中,,4℃避光保存,待測,。
胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟
1-6,、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟
7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul,,對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG,,輕輕吹打混勻,4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h,。離心,,棄上清。
8,、冷PBS 1ml離心洗滌1次,,以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體,。
9、加入PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200 ul,。吹打混勻,,4 ℃或置冰上孵育30 min,避光,。
10,、冷PBA 1ml離心洗滌2次。
11,、將細胞重新懸浮于500 ul PBS中,,混勻,置流式管中,,避光,,4 ℃冰箱保存,待測,。
備注:
1,、 RNase A: 貯液濃度:1mg/ml ;
工作液配制:加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,,使終濃度為 20ug/ml,。
2、PI: 貯液濃度:2.5mg/ml,;
工作液配制: 加2,、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,使終濃度為 50ug/ml,。
3,、PBA : 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白,加0.1%疊氮鈉,。
4、檢測樣品細胞濃度1x10 /ml,。
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