流式細胞技術(shù)實驗方法

PI 染色操作步驟

1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。

2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,，棄上清。

3,、加入2ml預(yù)冷的70%酒精,，4℃固定30min，或是-20℃固定過夜,。

4,、離心，棄上清液,。

5,、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心,。

6,、加入RNase A (工作濃度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min,，離心,。

7,、用1×PBS 1ml洗滌1次，離心,。

8,、加入PI(工作濃度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室溫避光孵育30min,。

9,、混勻，過300目篩網(wǎng),，置流式管中,， 4℃冰箱保存，待測,。

GFP PI染色操作步驟

1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。

2,、加入PBS 1ml離心洗滌1次,，棄上清。

3,、加入2ml預(yù)冷PFA,，PFA的濃度根據(jù)細胞的特點進行調(diào)節(jié)，4℃固定30min,。 以下步驟同PI 染色操作步驟的（4-9）

細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

1,、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中，離心,，1500rpm , 5min,，棄上清液。

2,、以冷PBA 1ml,，離心洗滌，棄上清液,。

3,、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul。用微量移液器輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30min-1h,。

4、離心棄上清液。

5,、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分。

6,、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中，4℃避光保存,，待測,。

細胞表面間接免疫熒光染色操作步驟

1-2、同細胞表面直接免疫熒光染色操作步驟

3,、 用PBA稀釋的*抗體200ul,，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG，輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育1,、5-2h。離心,，棄上清,。

4,、 PBS 1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體。

5,、 PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200ul,。吹打混勻，4℃或置冰上孵育30min,，避光,。

6、 PBS 1ml離心洗滌2次,。

7,、將細胞重新懸浮于500ulPBS中，混勻,，置流式管中,，避光，4℃冰箱保存,，待測,。

胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

1、將單細胞懸液加入2ml圓底離心管中,，離心,，1500 rpm , 5 min，棄上清液。

2,、用1×PBS 1 ml洗滌1次,，離心。

3,、4% PFA 1ml,，4 ℃固定30min。

4,、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心。

5,、0.1% Triton-100 1ml, 室溫10min,。

6、用1×PBS 1ml洗滌1次,，離心,。

7、加入用PBA稀釋的熒光素標記的抗體200ul,，用微量移液器輕輕吹打混勻,，4℃或置冰上孵育30 min-1h。

8,、離心棄上清液,。

9、加入冷PBS1ml,離心洗滌2次,，以除去未結(jié)合的多余抗體成分,。

10、向細胞中加入冷PBS 500ul,吹打混勻,，置流式管中,，4℃避光保存，待測,。

胞內(nèi)間接免疫熒光染色操作步驟

1-6,、同胞內(nèi)直接免疫熒光染色操作步驟

7、加入用PBA稀釋的*抗體200 ul,，對照管加入對應(yīng)于一抗的正常實驗動物IgG,，輕輕吹打混勻，4 ℃或置冰上孵育1.5-2 h,。離心,，棄上清。

8,、冷PBS 1ml離心洗滌1次,，以去除多余的未結(jié)合的特異性抗體,。

9、加入PBA適當稀釋的熒光素標記的第二抗體200 ul,。吹打混勻,，4 ℃或置冰上孵育30 min，避光,。

10,、冷PBA 1ml離心洗滌2次。

11,、將細胞重新懸浮于500 ul PBS中,，混勻，置流式管中,，避光,，4 ℃冰箱保存，待測,。
備注：

1,、 RNase A： 貯液濃度：1mg/ml ；

工作液配制：加1 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中,，使終濃度為 20ug/ml,。

2、PI： 貯液濃度：2.5mg/ml,；

工作液配制： 加2,、5 mg/ml貯液 10ul于500ul 1×PBS中，使終濃度為 50ug/ml,。

3,、PBA ： 即PBS加1-2% 牛血清白蛋白，加0.1%疊氮鈉,。

4、檢測樣品細胞濃度1x10 /ml,。