免疫組化步驟（ABC法）

1。4%多聚甲醛常規(guī)灌注固定,，取材并置20%蔗糖溶液（4℃）中過(guò)夜,。蠟塊制作。切片,，貼片,。0.01MKPBS清洗5min×3后； 

2,。加入配好的0.3%的過(guò)氧化氫甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%過(guò)氧化氫）30min,，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的影響，0.01MPBS清洗5min×3,； 

3,。加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MKPBS 100ml）30min，以增加細(xì)胞的通透性,，0.01MKPBS清洗5min×3,； 

4。加入用血清稀釋液（牛血清白蛋白1.00g＋0.01MPBS 100ml＋疊氮納0.08g）稀釋的一抗,，4℃存放24-48h,；吸去抗體，0.01MKPBS洗5min×3,； 

5,。加入0.01MKPBS稀釋的的二抗，室溫孵育2h,。0.01MKPBS洗5min×3,； 

6。加入ABC復(fù)合物之類(lèi)的抗體，室溫孵育2h,，0.01MKPBS洗5min×3,；蒸餾水迅速?zèng)_三次； 

7,。加入顯色液,，進(jìn)行免疫組織化學(xué)顯色，時(shí)間一般不超過(guò)30min,，可不時(shí)在顯微鏡下進(jìn)行觀察,，待細(xì)胞著色而背底顏色較淡時(shí)馬上吸去顯色液，用蒸餾水迅速?zèng)_三次后加入0.01MKPBS終止反應(yīng),； 

8,。梯度酒精脫水之后，封片,，拍照,。 

免疫組化SP法步驟：

SP(streptavidin-perosidase)法,即鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)法.

按標(biāo)記物質(zhì)的種類(lèi)，如熒光染料,、放射性同位素,、酶(主要有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酶)、鐵蛋白,、膠體金等,，可分為免疫熒光法、放射免疫法,、酶標(biāo)法和免疫金銀法等,。按染色步驟可分為直接法(又稱(chēng)一步法)和間接法(二步、三步或多步法),；按結(jié)合方式可分為抗原—抗體結(jié)合,，如過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶（PAP）法和親和連接，如卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物（ABC）法,、鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)（SP）法等,，其中SP法是zui常使用的方法。 

一般的sp法步驟啊,具體如下：

1.烤片,，68℃,，20分鐘,

2. 常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水,；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I(xiàn) 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min 

3.阻斷 滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min,，PBS沖洗3X5min；

4. 抗原修復(fù):置0.01M枸櫞酸緩沖液（PH 6.0）中用煮沸（95℃,，15－20min）,，自然冷卻20min 以上,，再用冷水沖洗缸子，加快冷卻至室溫,，PBS沖洗3X5min,。

5. 正常羊血清工作液封閉，37℃10 min,，傾去勿洗.

6. 滴加一抗4℃ 冰箱孵育過(guò)夜，PBS沖洗3X5min（用PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照）,；

滴加生物素標(biāo)記二抗, 37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;

7. 滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素卵白素工作液,，37℃孵育30min, PBS沖洗3X5min;

8. DAB/ H2O2反應(yīng)染色，自來(lái)水充分沖洗后,，

蘇木素復(fù)染,，常規(guī)脫水，透明,，干燥,，封片。

免疫組化（Elivision二步法）：

（1）石蠟切片置于67℃烘箱中,，烘片2小時(shí),，脫蠟至水，用pH7.4的PBS沖洗三次,，每次3分鐘（3×3’）,。

（2）取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液，加入微波盒中,，微波加熱至沸騰,，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,，放入已沸騰的緩沖液中,，中檔微波處理10分鐘，取出微波盒流水自然泠卻,，從緩沖液中取出玻片,，先用蒸餾水沖洗兩次，之后用PBS沖洗2×3’,。(注：不是所有的抗體都需要微波修復(fù)的,，視具體情況而定)

（3）每張切片加1滴3% H2O2，室溫下孵育10分鐘,，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性,。PBS沖洗3×3’。

（4）除去PBS液,，每張切片加1滴相應(yīng)的*抗體（相應(yīng)稀釋倍數(shù)）,，室溫下孵育2小時(shí),。

（5）PBS沖洗3×5’。除去PBS液,，每張切片加1滴聚合物增強(qiáng)劑（試劑A）,，室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’,。

（6）除去PBS液,，每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物（試劑B），室溫下孵育30分鐘,。PBS沖洗3×5’

（7）除去PBS液,，每張切片加1滴新鮮配制的DAB液，顯微鏡下觀察5分鐘,。

（8）蘇木素復(fù)染,，0.1%HCl分化，自來(lái)水沖洗,，藍(lán)化,，切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明,，中性樹(shù)膠封固,，晾干后觀察。

注：即用型第二代免疫組化Elivision plus廣譜試劑盒,，購(gòu)自福州脈新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司,。包括：生物素化抗兔二抗、親和素（Reagent A）,、生物素－辣根過(guò)氧化物酶（Reagent B）,、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）