在討論流式細胞術中熒光補償該如何調(diào)節(jié)的問題前，我們先了解下流式實驗為何需要調(diào)補償,？

熒光分子在被激發(fā)后都會發(fā)射特定波長范圍的光,，但是這些熒光的發(fā)射光之間會發(fā)生光譜重疊。

熒光補償?shù)恼{(diào)節(jié)是糾正熒光素發(fā)射光譜重疊的過程,，即從一個被檢測的熒光信號中減掉溢漏過來的其他光,。

熒光發(fā)射光光譜重疊示例：

以FITC和PE為例來看光譜重疊。FITC單染管的熒光會部分漏到PE通道中,，而這部分需要從PE通道中減掉溢漏過來的FITC熒光,。

那么熒光補償該如何調(diào)節(jié)呢？

? 調(diào)節(jié)電壓

? 檢測熒光通道的自發(fā)熒光

? 每個熒光通道做單染管對照檢測

何為單染管對照,？

? 細胞

? 補償微球

細胞通常是流式抗體單染管對照的樣本,，但是當細胞數(shù)量有限,，無多余細胞用于抗體單染或感興趣的表面抗原表達較低，陽性分群不明顯不足以用來調(diào)節(jié)補償時,，建議選擇補償微球,。

補償調(diào)節(jié)時要注意：

? 使用未染色的細胞做PMT的電壓設置

? 不要使用未染色的補償微球設置電壓

eBioscience提供兩種補償微球：OneComp eBeads與UltraComp eBeads。

微球大小和淋巴細胞相當,，可連接各種熒光標記的抗體來調(diào)節(jié)補償,。每滴微球中都含有兩群：一群是可以結合抗體的陽性群，一群是不會與抗體反應的陰性群,。

優(yōu)點：

? 使用方便,，一滴即可

? 使用實驗抗體與微球有效結合調(diào)節(jié)補償，無需再用CD4分群來調(diào)節(jié)

? 細胞替代物,，適應各種孵育時間,，結果穩(wěn)定

? 能與各種種屬和亞型的抗體反應

競爭品牌的微球是分種屬的，使用不同抗體要購買多個產(chǎn)品以使用

注：兔來源的抗體與微球結合力較弱,，但某些還是可以使用

? 適用于各種激發(fā)光---適用于488 nm 藍光,，532 nm 綠光,，561 nm 黃光，633-635 nm 紅光,，UltraComp eBeads尤其適用紫外 (355 nm) 或者 紫色 (405 nm) 激光器

? 微球本身信號經(jīng)過優(yōu)化適合補償調(diào)節(jié)

? 價格相當,，有小包裝

操作步驟：

1. 準備好流式管,，每種熒光抗體一個；

2. 將微球翻轉或者渦旋混勻,；

3. 在每管中加入一滴微球；

4. 在管中分別加入相應的 1 test 抗體（不同抗體 1 test 的用量不同，具體參見說明書）,；

5. 敲擊或者渦旋混勻,；

6. 2-8℃暗處孵育 15-30 分鐘,；

7. 每管加 2ml 流式染色緩沖液,，400-600 x g 離心 3-5 分鐘,；

8. 棄上清，每管加入 0.2-0.4 mL 流式染色緩沖液,；

9. 混勻后上機