1 冷凍管應(yīng)如何解凍,？ 
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍,， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化,， 并注意水面不可超過冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形,。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂,。 

2 細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 
除少數(shù)特別注明對DMSO 敏感之細胞外,， 絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞）,， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,， 如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題,。 

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
不能,。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基,， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細胞大都無法立即適應(yīng),， 造成細胞無法存活,。 

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 
不能,。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,， 所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。 

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? FBS （fetal bovine serum） 和FCS （fetal calf serum） 是相同的意思,， 兩者都是指胎牛血清,， FCS 乃錯誤的使用字眼， 請不要再使用,。CS （calf serum） 則是指小牛血清,。HS （horseserum） 則是指馬血清。
 
6 培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用5 % 或10% CO2,？或根本沒有影響,？ 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2 濃度,。當培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時,，細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10 % CO2；當培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時,， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細胞,。

7 何時須更換培養(yǎng)基？ 
視細胞生長密度而定,， 或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,，按時更換培養(yǎng)基即可。
 
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,？ 
除于特殊篩選系統(tǒng)中外,， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素,。
 
9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度,？應(yīng)如何處理？ 一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。*次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于-20 °C,，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 之活性降低,， 并可減少污染之機會,。 

10 懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理,？ 
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中， 稀釋細胞濃度即可,， 若培養(yǎng)液太多時,， 可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高， 直到無法容納為止,。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,， 加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當濃度， 重復(fù)前述步驟即可,。 

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速,？
欲回收動物細胞,， 其離心速率一般為300xg （約1,000rpm），5 - 10 分鐘,， 過高之轉(zhuǎn)速,， 將造成細胞死亡。 

12 細胞之接種密度為何,？ 
依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可,。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。 

13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何,？ 
動物細胞冷凍保存時zui常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10 %DMSO （dimethyl sulfoxide） 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之,。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能， 故不可將DMSO 直接加入細胞液中,， 必須使用前先行配制完成,。 

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？ 
冷凍保存使用之DMSO 等級,， 必須為Tissue culture grade之DMSO （如Sigma D2650）,， 其本身即為無菌狀況， *次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,， 保存于4°C,， 避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì)， 并可減少污染之機會,。若要過濾DMSO,， 則須使用耐DMSO 之Nylon 材質(zhì)濾膜。 

15 冷凍保存細胞之方法？ 
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ （-20 °C30 分鐘*） → -80 °C 16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存,。 冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至-80 °C 以下,， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時,， 以防止冰晶過大,，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中,，惟存活率稍微 降低一些,。 

16 細胞欲冷凍保存時， 細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度,？
 冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,， 融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

17 應(yīng)如何避免細胞污染,？ 
細胞污染的種類可分成細菌,、酵母菌、霉菌,、病毒和霉?jié){菌,。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當、操作室環(huán)境不佳,、污染之血清和污染之細胞等,。嚴格之無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境,、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法,。 

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應(yīng)如何處理,？ 
直接滅菌后丟棄之,。 

19 支原體（mycoplasma） 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀,？ 
不能,。除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株,， 無法以其外觀分辨之,。 

20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？ 
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù),， 代謝及研究之任一數(shù)據(jù),。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free,，實驗結(jié)果之數(shù)據(jù)方有意義,。 

21 偵測出細胞株有支原體污染時,， 該如何處理？直接滅菌后丟棄,，以避免污染其它細胞株,。 

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？ 
定期（至少每兩周一次） 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之,。 

23 為何培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 顏色會偏暗紅色， 且pH值會越來越偏堿性,？ 
培養(yǎng)基保存于4 °C 冰箱中,， 培養(yǎng)基內(nèi)之CO2 會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑（通常為phenol red） 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅,。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果， 將造成細胞生長停滯或死亡,。若培養(yǎng)基偏堿時,， 可以通入無菌過濾之CO2， 以調(diào)整pH 值,。 

24 各種細胞培養(yǎng)用的dish,，flask是否均相同？ 
不同廠牌的dish 或flask,， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同,， 雖對大部分細胞沒有太大之影響,， 惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。 

25 購買之細胞冷凍管經(jīng)解凍后,，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少之情形,？ 
研究人員在冷凍細胞之培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少， 大都是因為離心過程操作上的失誤,， 造成細胞的物理性損傷,， 以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心,， 應(yīng)待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。 

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？ 
研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,， 常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳,。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過程錯誤,。冷凍細胞解凍后,， 加以洗滌細胞和離心,。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤,。細胞置于-80 °C 太久,。 

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋,，或瓶蓋脫落之原因,？ 
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂,，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取,。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,，乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染,，故冷凍管于放入和取出液氮桶時,，均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。