無菌操作基本技術
1. 實驗進行前,，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌,，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面,，并開啟無菌操作臺風扇運轉(zhuǎn)10 分鐘后,，才開始實驗操作,。每次操作只處理一株細胞株,，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基,，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后,，將實驗物品帶出工作臺,，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉(zhuǎn)10 分鐘以上后,，再進行下一個細胞株之操作,。
2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品,，例如試管架,、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出,，以利于氣流之流通,。實驗用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內(nèi)。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域,，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作,。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染,。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口,，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后,，以手夾住瓶蓋并握住瓶身,，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全,，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗,。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺（至少Class II）,。操作過程中,，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，小心毒性藥品,，例如DMSO 及TPA 等,，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度,、溫度,、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）,。 5.3. 無菌操作臺內(nèi)之a(chǎn)irflow 壓力,，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)（300小時/預濾網(wǎng),，3000 小時/HEPA）,。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水,。

實驗用品
1. 種類?
  1.1. 細胞培養(yǎng)實驗用品均為無菌,，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品,。
  1.2. TC 級培養(yǎng)盤表面均有coating 高分子物質(zhì)以讓細胞吸附,，培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用,。
  1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
  1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml,，均有2 種不同材質(zhì)，其中polypropylene （PP） 為不透明材質(zhì),，polystyrene （PS） 為透明材質(zhì),，可依實驗需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。
  1.5. glass pastuer pipet: 9 inch,，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等,。
  1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數(shù)小時，洗凈后才開始使用,。 2.2. 用過之玻璃血清瓶,，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈,，勿加清潔劑清洗,。
3. 滅菌?
  3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干,。
  3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時,。  
  3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理,。

培養(yǎng)基
1. 液體培養(yǎng)基貯存于4℃冰箱,，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱,。
2. 液體培養(yǎng)基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解,，若細胞生長不佳,，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養(yǎng)基配制（以1 升為例）：
  3.1. 細胞培養(yǎng)基通常須添加10% 血清,，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml,，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加,，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會造成pH 之誤差,，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合,，然后用CO2 氣體調(diào)整pH,，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細胞生長可能有影響,，且貯存時培養(yǎng)基的pH 易發(fā)生改變,。   3.2. 材料：
   3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要）
   3.2.2. 粉末培養(yǎng)基
   3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
   3.2.4. 電磁攪拌器
   3.2.5. 無菌血清瓶
   3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
   3.2.7. pH meter
   3.2.8. 真空幫浦
   3.2.9. CO2 氣體
  3.3. 步驟：
   3.3.1. 取粉末培養(yǎng)基溶于700ml milli-Q 水中,，攪拌使其溶解,。
   3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末（數(shù)量依培養(yǎng)基種類而異，表一）溶于200ml milli-Q 水中,，攪拌使其溶解,，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘,。
   3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養(yǎng)基中混合,。混后溶液之pH應為7.2-7.4,，除非pH 值偏差太大,，否則不需用酸堿再調(diào)整之。若為太堿,，可再通入CO2 氣體調(diào)整pH,。培養(yǎng)基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
   3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌,，同時分裝至無菌容器中,，標示培養(yǎng)基種類、日期,、瓶號等,，貯存于4℃。（血清亦可加入培養(yǎng)基中一起過濾）
   3.3.5. 配制之培養(yǎng)基配制須作生長試驗與污染測試,。
4. 配制培養(yǎng)基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK cell,，接種MDCK 細胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每個well 接種1 × 102 活細胞,，同時作對照組實驗,。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長,，待細胞群落大到可以肉眼觀察,，而群落間不互相接觸時即可。 4.2.3. 去除培養(yǎng)基,，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1）,，室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液,，水洗二次,。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，,，室溫下靜置染色2-3 min,。
4.2.6. 去除染液，水洗二次,。
4.2.7. 以肉眼計數(shù)群落數(shù),，并比較之，若新配制或新批號的培養(yǎng)基對細胞生長不佳,，則丟棄之,。