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HPLC液相色譜系統(tǒng)的選型
HPLC系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器,、色譜柱,、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成,。其中輸液泵,、色譜柱,、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置,、在線脫氣機(jī),、自動(dòng)進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱,、柱溫控制器等,，現(xiàn)代HPLC儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動(dòng)化儀器控制和數(shù)據(jù)處理,。制備型HPLC儀還備有自動(dòng)餾分收集裝置,。
zui早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱,、固定波長的檢測器,、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積,。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫,，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器,、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器,、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀,，逐漸取而代之的是zui簡單的積分儀,、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng),。
目前常見的HPLC儀生產(chǎn)廠家國外有Waters公司,、Agilent公司(原HP公司)、島津公司等,，國內(nèi)有大連依利特公司,、上海分析儀器廠、北京分析儀器廠等,。
*步：輸掖泵的選擇
輸液泵是HPLC系統(tǒng)中zui重要的部件之一,。泵的性能好壞直接影響到整個(gè)系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可*性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定,，其RSD應(yīng)<0.5%,，這對(duì)定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要;②流量范圍寬，分析型應(yīng)在0.1~10ml/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào),，制備型應(yīng)能達(dá)到100ml/min;③輸出壓力高,，一般應(yīng)能達(dá)到150~300kg/cm2;④液缸容積小;⑤密封性能好，耐腐蝕,。
泵的種類很多,，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵,。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵,。恒壓泵受柱阻影響,，流量不穩(wěn)定;螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰,。目前應(yīng)用zui多的是柱塞往復(fù)泵,。
柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至0.1ml,，因此易于清洗和更換流動(dòng)相,，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫;改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻影響;泵壓可達(dá)400kg/cm2.其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大,，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服,。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好(RSD為0.1%左右,，串聯(lián)泵為0.2~0.3%),，但出故障的機(jī)會(huì)較多(因多一單向閥)，價(jià)格也較貴,。
第二步：進(jìn)樣器的選擇
早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器,，裝在色譜柱入口處。現(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動(dòng)進(jìn)樣器,。進(jìn)樣裝置要求：密封性好,，死體積小,，重復(fù)性好,，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時(shí)對(duì)色譜系統(tǒng)的壓力,、流量影響小,。HPLC進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣,、閥進(jìn)樣,、自動(dòng)進(jìn)樣。
1.隔膜進(jìn)樣,。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi),，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零,，可以獲得*的柱效,，且價(jià)格便宜，操作方便,。但不能在高壓下使用(如10MPa以上);此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng),，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到1~2%;加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到,，常規(guī)分析使用受到限制。
2.停流進(jìn)樣,?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在HPLC中由于隔膜的污染,，停泵或重新啟動(dòng)時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)鬼峰;另一缺點(diǎn)是保留時(shí)間不準(zhǔn),。在以峰的始末信號(hào)控制餾分收集的制備色譜中，效果較好,。
3.閥進(jìn)樣,。一般HPLC分析常用六通進(jìn)樣閥(以美國Rheodyne公司的7725和7725i型zui常見)，其關(guān)鍵部件由圓形密封墊(轉(zhuǎn)子)和固定底座(定子)組成,。由于閥接頭和連接管死體積的存在,，柱效率低于隔膜進(jìn)樣(約下降5~10%左右)，但耐高壓(35~40MPa),，進(jìn)樣量準(zhǔn)確,，重復(fù)性好(0.5%)，操作方便,。
4.自動(dòng)進(jìn)樣,。用于大量樣品的常規(guī)分析。
第三步：色譜柱的選擇
色譜是一種分離分析手段,，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟,。對(duì)色譜柱的要求是柱效高,、選擇性好，分析速度快等,。市售的用于HPLC的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相,、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球(包括離子交換樹脂),、多孔碳等,，其粒度一般為3，5,，7,，10μm等，柱效理論值可達(dá)5~16萬/米,。對(duì)于一般的分析只需5000塔板數(shù)的柱效;對(duì)于同系物分析,，只要500即可;對(duì)于較難分離物質(zhì)對(duì)則可采用高達(dá)2萬的柱子，因此一般10~30cm左右的柱長就能滿足復(fù)雜混合物分析的需要,。
柱效受柱內(nèi)外因素影響,，為使色譜柱達(dá)到*效率,，除柱外死體積要小外，還要有合理的柱結(jié)構(gòu)(盡可能減少填充床以外的死體積)及裝填技術(shù),。即使的裝填技術(shù),，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，*近管壁的部位比較疏松,，易產(chǎn)生溝流,，流速較快，影響沖洗劑的流形,，使譜帶加寬,，這就是管壁效應(yīng)。這種管壁區(qū)大約是從管壁向內(nèi)算起30倍粒徑的厚度,。在一般的液相色譜系統(tǒng)中,，柱外效應(yīng)對(duì)柱效的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于管壁效應(yīng)。
1.柱的構(gòu)造
色譜柱由柱管,、壓帽,、卡套(密封環(huán))、篩板(濾片),、接頭,、螺絲等組成。柱管多用不銹鋼制成,，壓力不高于70kg/cm2時(shí),，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度,。為提高柱效,，減小管壁效應(yīng)，不銹鋼柱內(nèi)壁多經(jīng)過拋光,。也有人在不銹鋼柱內(nèi)壁涂敷氟塑料以提高內(nèi)壁的光潔度,，其效果與拋光相同,。還有使用熔融硅或玻璃襯里的,，用于細(xì)管柱。色譜柱兩端的柱接頭內(nèi)裝有篩板,，是燒結(jié)不銹鋼或鈦合金,，孔徑0.2~20μm(5~10μm)，取決于填料粒度,，目的是防止填料漏出,。
色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：①常規(guī)分析柱(常量柱),，內(nèi)徑2~5mm(常用4.6mm,，國內(nèi)有4mm和5mm),，柱長10~30cm;②窄徑柱(narrowbore，又稱細(xì)管徑柱,、半微柱semi-microcolumn),，內(nèi)徑1~2mm，柱長10~20cm;③毛細(xì)管柱(又稱微柱microcolumn),，內(nèi)徑0.2~0.5mm;④半制備柱,，內(nèi)徑>5mm;⑤實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑20~40mm,，柱長10~30cm;⑥生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米,。柱內(nèi)徑一般是根據(jù)柱長、填料粒徑和折合流速來確定,，目的是為了避免管壁效應(yīng),。
2.柱的發(fā)展方向
因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長3~10cm,，填料粒徑2~3μm.為提高分析靈敏度,，與質(zhì)譜(MS)聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱,、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱(microbore),。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：①節(jié)省流動(dòng)相;②靈敏度增加;③樣品量少;④能使用長柱達(dá)到高分離度;⑤容易控制柱溫;⑥易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。
但由于柱體積越來越小,，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著,，需要更小池體積的檢測器(甚至采用柱上檢測)，更小死體積的柱接頭和連接部件,。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1~100μl/min的低流量,，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品,。且因上樣量小,，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn),。
3.柱的填充和性能評(píng)價(jià)
色譜柱的性能除了與固定相性能有關(guān)外,，還與填充技術(shù)有關(guān)。在正常條件下,，填料粒度>20μm時(shí),，干法填充制備柱較為合適;顆粒<20μm時(shí)，濕法填充較為理想,。填充方法一般有4種：①高壓勻漿法,，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充;②徑向加壓法，Waters;③軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱;④干法,。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng),，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱。
必須指出,，液相色譜柱的獲得,，裝填技術(shù)是重要環(huán)節(jié)，但根本問題還在于填料本身性能的優(yōu)劣,，以及配套的色譜儀系統(tǒng)的的結(jié)構(gòu)是否合理,。
無論是自己裝填的還是購買的色譜柱，使用前都要對(duì)其性能進(jìn)行考察,，使用期間或放置一段時(shí)間后也要重新檢查,。柱性能指標(biāo)包括在一定實(shí)驗(yàn)條件下(樣品、流動(dòng)相,、流速,、溫度)下的柱壓、理論塔板高度和塔板數(shù),、對(duì)稱因子,、容量因子和選擇性因子的重復(fù)性，或分離度,。一般說來容量因子和選擇性因子的重復(fù)性在±5%或±10%以內(nèi),。進(jìn)行柱效比較時(shí)，還要注意柱外效應(yīng)是否有變化,。
一份合格的色譜柱評(píng)價(jià)報(bào)告應(yīng)給出柱的基本參數(shù),，如柱長、內(nèi)徑,、填料的種類,、粒度、色譜柱的柱效,、不對(duì)稱度和柱壓降等,。
第四步：檢測器的選擇
檢測器是HPLC儀的三大關(guān)鍵部件之一。其作用是把洗脫液中組分的量轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào),。HPLC的檢測器要求靈敏度高,、噪音低(即對(duì)溫度、流量等外界變化不敏感),、線性范圍寬,、重復(fù)性好和適用范圍廣。
1.分類
1)按原理可分為光學(xué)檢測器(如紫外,、熒光、示差折光、蒸發(fā)光散射),、熱學(xué)檢測器(如吸附熱),、電化學(xué)檢測器(如極譜、庫侖,、安培),、電學(xué)檢測器(電導(dǎo)、介電常數(shù),、壓電石英頻率),、放射性檢測器(閃爍計(jì)數(shù)、電子捕獲,、氦離子化)以及氫火焰離子化檢測器,。
2)按測量性質(zhì)可分為通用型和專屬型(又稱選擇性)。通用型檢測器測量的是一般物質(zhì)均具有的性質(zhì),，它對(duì)溶劑和溶質(zhì)組分均有反應(yīng),，如示差折光、蒸發(fā)光散射檢測器,。通用型的靈敏度一般比專屬型的低,。專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質(zhì)，如紫外,、熒光檢測器,，它們只對(duì)有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應(yīng),。
3)按檢測方式分為濃度型和質(zhì)量型,。濃度型檢測器的響應(yīng)與流動(dòng)相中組分的濃度有關(guān)，質(zhì)量型檢測器的響應(yīng)與單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的組分的量有關(guān),。
4)檢測器還可分為破壞樣品和不破壞樣品的兩種,。
2.性能指標(biāo)
1)噪音和漂移：在儀器穩(wěn)定之后，記錄基線1小時(shí),，基線帶寬為噪音,，基線在1小時(shí)內(nèi)的變化為漂移。它們反映檢測器電子元件的穩(wěn)定性,，及其受溫度和電源變化的影響,，如果有流動(dòng)相從色譜柱流入檢測器，那么它們還反映流速(泵的脈動(dòng))和溶劑(純度,、含有氣泡,、固定相流失)的影響。噪音和漂移都會(huì)影響測定的準(zhǔn)確度,，應(yīng)盡量減小,。
2)靈敏度(sensitivity)：表示一定量的樣品物質(zhì)通過檢測器時(shí)所給出的信號(hào)大小,。對(duì)濃度型檢測器，它表示單位濃度的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小,，單位為mV.ml/g.對(duì)質(zhì)量型檢測器,，它表示在單位時(shí)間內(nèi)通過檢測器的單位質(zhì)量的樣品所產(chǎn)生的電信號(hào)的大小，單位為mV.s/g.
3)檢測限(detectionlimit)
檢測器靈敏度的高低,，并不等于它檢測zui小樣品量或zui低樣品濃度能力的高低,，因?yàn)樵诙x靈敏度時(shí)，沒有考慮噪聲的大小,，而檢測限與噪聲的大小是直接有關(guān)的,。
檢測限指恰好產(chǎn)生可辨別的信號(hào)(通常用2倍或3倍噪音表示)時(shí)進(jìn)入檢測器的某組分的量(對(duì)濃度型檢測器指在流動(dòng)相中的濃度注意與分析方法檢測限的區(qū)別，單位g/ml或mg/ml;對(duì)質(zhì)量型檢測器指的是單位時(shí)間內(nèi)進(jìn)入檢測器的量,，單位g/s或mg/s),。又稱為敏感度(detectability)。D=2N/S,，式中N為噪聲,，S為靈敏度。通常是把一個(gè)已知量的標(biāo)準(zhǔn)溶液注入到檢測器中來測定其檢測限的大小,。
檢測限是檢測器的一個(gè)主要性能指標(biāo),，其數(shù)值越小，檢測器性能越好,。值得注意的是,，分析方法的檢測限除了與檢測器的噪聲和靈敏度有關(guān)外，還與色譜條件,、色譜柱和泵的穩(wěn)定性及各種柱外因素引起的峰展寬有關(guān),。
4)線性范圍(linearrange)：指檢測器的響應(yīng)信號(hào)與組分量成直線關(guān)系的范圍，即在固定靈敏度下,，zui大與zui小進(jìn)樣量(濃度型檢測器為組分在流動(dòng)相中的濃度)之比,。也可用響應(yīng)信號(hào)的zui大與zui小的范圍表示，例如Waters996PDA檢測器的線性范圍是-0.1~2.0A.
定量分析的準(zhǔn)確與否,，關(guān)鍵在于檢測器所產(chǎn)生的信號(hào)是否與被測樣品的量始終呈一定的函數(shù)關(guān)系,。輸出信號(hào)與樣品量呈線性關(guān)系，這樣進(jìn)行定量測定時(shí)既準(zhǔn)確又方便,。但實(shí)際上沒有一臺(tái)檢測器能在任何范圍內(nèi)呈線性響應(yīng),。通常A=BCx，B為響應(yīng)因子,，當(dāng)x=1時(shí),，為線性響應(yīng)。對(duì)大多數(shù)檢測器來說,，x只在一定范圍內(nèi)才接近于1,，實(shí)際上通常只要x=0.98~1.02就認(rèn)為它是呈線性的,。
線性范圍一般可通過實(shí)驗(yàn)確定。我們希望檢測器的線性范圍盡可能大些,，能同時(shí)測定主成分和痕量成分,。此外還要求池體積小,，受溫度和流速的影響小,，能適合梯度洗脫檢測等。
5)池體積：除制備色譜外,，大多數(shù)HPLC檢測器的池體積都小于10μl.在使用細(xì)管徑柱時(shí),，池體積應(yīng)減少到1~2μl甚至更低，不然檢測系統(tǒng)帶來的峰擴(kuò)張問題就會(huì)很嚴(yán)重,。而且這時(shí)池體,、檢測器與色譜柱的連接、接頭等都要精心設(shè)計(jì),，否則會(huì)嚴(yán)重影響柱效和靈敏度,。
第五步：數(shù)據(jù)處理和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)
早期的HPLC儀器是用記錄儀記錄檢測信號(hào)，再手工測量計(jì)算,。其后,，使用積分儀計(jì)算并打印出峰高、峰面積和保留時(shí)間等參數(shù),。80年代后,，計(jì)算機(jī)技術(shù)的廣泛應(yīng)用使HPLC操作更加快速、簡便,、準(zhǔn)確,、精密和自動(dòng)化，現(xiàn)在已可在互聯(lián)網(wǎng)上遠(yuǎn)程處理數(shù)據(jù),。計(jì)算機(jī)的用途包括三個(gè)方面：①采集,、處理和分析數(shù)據(jù);②控制儀器;③色譜系統(tǒng)優(yōu)化和專家系統(tǒng)。
第六步：恒溫裝置
在HPLC儀中色譜柱及某些檢測器都要求能準(zhǔn)確地控制工作環(huán)境溫度,，柱子的恒溫精度要求在±0.1~0.5℃之間,，檢測器的恒溫要求則更高。
溫度對(duì)溶劑的溶解能力,、色譜柱的性能,、流動(dòng)相的粘度都有影響。一般來說,，溫度升高,，可提高溶質(zhì)在流動(dòng)相中的溶解度，從而降低其分配系數(shù)K,，但對(duì)分離選擇性影響不大;還可使流動(dòng)相的粘度降低,，從而改善傳質(zhì)過程并降低柱壓,。但溫度太高易使流動(dòng)相產(chǎn)生氣泡。
色譜柱的不同工作溫度對(duì)保留時(shí)間,、相對(duì)保留時(shí)間都有影響,。在凝膠色譜中使用軟填料時(shí)溫度會(huì)引起填料結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)分離有影響;但如使用硬質(zhì)填料則影響不大,。
總的說來,，在液固吸附色譜法和化學(xué)鍵合相色譜法中，溫度對(duì)分離的影響并不顯著,，通常實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行操作,。在液固色譜中有時(shí)將極性物質(zhì)(如緩沖劑)加入流動(dòng)相中以調(diào)節(jié)其分配系數(shù)，這時(shí)溫度對(duì)保留值的影響很大,。
不同的檢測器對(duì)溫度的敏感度不一樣,。紫外檢測器一般在溫度波動(dòng)超過±0.5℃時(shí)，就會(huì)造成基線漂移起伏,。示差折光檢測器的靈敏度和zui小檢出量常取決于溫度控制精度,，因此需控制在±0.001℃左右，微吸附熱檢測器也要求在±0.001℃以內(nèi),。