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天狼猩紅總膠原檢測試劑盒

Sirius Red Total Collagen Detection Assay Kit（Catalog # 9062）

僅用于科研,，不可用于診斷

背景簡介：

天狼星紅是一種*的染料，它與纖維性膠原（I型至V型）上的[Gly-X-Y]n螺旋結構特異性結合,，不區(qū)分膠原蛋白種類和膠原類型,，因此用于總膠原的檢測。Chondrex提供天狼星紅總膠原蛋白檢測試劑盒,，用于檢測樣本,，包括：組織,、細胞培養(yǎng)液和細胞中的總膠原蛋白。該試劑盒可檢測40例樣本（復孔）,，實驗時間少于30min,。由于細胞培養(yǎng)液總的膠原含量較低，可能需要對樣本做濃縮處理,。

產(chǎn)品說明：

產(chǎn)品描述：用于檢測樣本中的總膠原

形式：96孔可拆版

檢測方法：比色法

實驗時間：30min

檢測范圍：500 µg/ml to 8 µg/m

檢測數(shù)量：40（復孔）樣本/板

樣本類型：組織勻漿,、細胞培養(yǎng)液、細胞

樣本稀釋比：根據(jù)樣本類型而定

發(fā)色團：N/A(510-550nm讀取)

保存：-20℃ 保存12個月

試劑盒組成：

注：1）洗液,，提取液,，0.5M的醋酸和96孔板也可以室溫保存

2）用于細胞培養(yǎng)液樣本的的濃縮液（50 ml, Catalog # 90626)）不包括在盒子內(nèi)，需要單獨訂購,。

樣本制備：

可用于檢測組織勻漿樣本和細胞,。固體樣本需要溶解后檢測。此外,，細胞培養(yǎng)液需要做濃縮處理（請參照第三頁實驗步驟）,。另外，熱變性的膠原對天狼猩紅的結合性差,，會導致結果值偏低,。

依據(jù)溶解緩沖液的不同，以下膠原樣本可用于檢測：

1. 中性緩沖液溶解的膠原溶液（0.15mol/L NaCl in 0.1M Tris-HCl, pH 7.4）

2. 醋酸溶解的膠原溶液（0.05mol/L的醋酸）

3. 含胃蛋白酶的膠原溶液（0.05mol/L的醋酸,，含胃蛋白酶）

Chondrex 推薦“制備含胃蛋白酶的可溶液膠原溶液"制備方案

細胞培養(yǎng)液樣本制備：

含高濃度血清的細胞培養(yǎng)物會導致高背景值,。因此，我們推薦用PBS降低細胞培養(yǎng)物中的血清濃度到5%,。

樣本濃縮：

細胞培養(yǎng)物中的血清濃度一般來說很低,，因此用試劑盒直接檢測細胞培養(yǎng)物中的膠原很難檢測得到。Chondrex公司通過濃縮液（Cat # 90626)參照樣本濃縮流程對樣本進行濃縮,。如果檢測細胞培養(yǎng)物,，請設置陰性對照,，用濃縮液的話可能會導致背景升高,。

1. 加入1ml細胞培養(yǎng)液

2. 加入250ul濃縮緩沖液

3. 渦旋混勻后，4℃孵育16-24小時

4. 10000rpm離心3min

5. 棄上清液

6. 加入100ul 0.05mol/L的醋酸溶解沉淀物,。用溶解后的樣本,，作為檢測樣本。

7. 樣本中膠原濃度為測定值x0.1,。

操作流程：

1. 加入100ul稀釋后的標準品和樣本到管內(nèi),。

2. 加入500ul天狼猩紅溶液到管內(nèi)

3. 混勻后，室溫孵育20min,10000rmp離心3min,小心吸取上清,，并棄上清,。

4. 加入250ul提取液到各管內(nèi),。

5. 渦旋混勻使沉淀物*溶解。

6. 從各管內(nèi)取200ul到檢測板

7. 讀取530nm(510-550nm)吸光度

注意：

1. 推薦標準品和樣本均做復孔檢測

2. 所有的緩沖液在用前置于室溫平衡,。

3. 用移液管準確定量緩沖液體積,，提供的緩沖液都是足量的。

4. 如果一次用不完的原液試劑,，請還在原瓶內(nèi)-20℃保存,，用于后續(xù)實驗。

5. 試劑盒含有未感染的動物的動物組分,，丟棄請做生物安全處理,。

實驗流程：

1. 1X醋酸溶液制備：用雙蒸水，制備足夠的1X醋酸溶液（0.05M）,。

2. 標準品制備：用1.5ml離心管或者細胞培養(yǎng)管制備標準品溶液,，加入250ul 0.05mol/L的醋酸（空白）到7管內(nèi)。加入250ul標準品（500ug/ml）和等體積的0.05mol/L的醋酸混合（250ug/ml）,。一次重復此步驟,，制備：125,63,31.5,16，和8ug/ml標準品溶液

1. 樣本制備：用1.5ml離心管或者細胞培養(yǎng)管制備樣本溶液,。如果樣本中的膠原濃度范圍不確定,，需要用0.05mol/L的醋酸溶液做系列稀釋后，確定樣本大概范圍后再檢測,。

2. 加入樣本和標準品：加入100ul ,空白,，稀釋后的標準品和樣本到離心管內(nèi)，做復管,。

3. 加入天狼猩紅溶液：加入500ul天狼猩紅溶液到各管,。渦旋混勻，室溫孵育20min,。

4. 離心：10000rpm離心3min,。去除上清，不要接觸底部的沉淀物,。如果不小心接觸到,，重新離心，小心去除上清,。

5. 加入洗液：加入500ul洗液到各管,。渦旋混勻后，重懸沉淀物,。

6. 離心：10000rpm離心3min,。去除上清，不要接觸底部的沉淀物,。如果不小心接觸到,，重新離心,，小心去除上清。

7. 加入提取液：加入250ul提取液到各管,。渦旋混勻后,，充分溶解。

8. 讀數(shù)：從各管取200ul到96孔板,。讀取510-550nm的吸光度值,。

結果計算：

1. 計算標準品，空白和檢測樣本的OD平均值,。

2. 用標準品和樣本OD平均值減去空白OD均值,。

3. Y軸做OD值，X軸做標準品濃度,，制作標準曲線,。

4. 通過回歸曲線計算樣本濃度。樣本實際濃度應在測值的基礎上乘以相應的稀釋倍數(shù),。

5. 如果OD值超出標準品檢測范圍,，請對樣本做稀釋后，再檢測,。