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人宮頸癌蛋白（hHCCR-1）ELISA 檢測試劑盒

                                              Cat.No：PY-30001

1 試劑盒組分

注：2-8 ℃保存,。

2需自備的試劑和耗材

3 檢測原理

 該試劑盒基于夾心ELISA 檢測原理,，包含針對目的蛋白的捕獲抗體和檢測抗體，用于檢測樣品中的hHCCR-1。

1. 用1x 捕獲抗體包被ELISA 板,。
2. 用5% 的脫脂乳封閉。
3. 檢測樣品和標準品的孵育,。
4. 用HRP 標記的IgY檢測hHCCR-1,。
5. TMB 顯色,。

1. 試劑的準備

  注：按以下步驟準備工作液。所有準備的試劑應(yīng)充分混勻并在用前置于室溫預(yù)熱,。

1）1X 稀釋緩沖液：用前用雙蒸水稀釋10X 的緩沖液到1X,。

2）1X捕獲抗體IgY：用1X 稀釋緩沖液稀釋20X IgY捕獲抗體。

3) ELISA 96孔板：

  選擇需要的孔數(shù),，剩余的孔放入置干燥劑的密封袋中,，袋需要重新密封，避免受潮,。

1. 血液的收集和儲存

1 ）  制備血清樣品,。

• 全血樣品置于離心管中（不含抗凝劑），置于室溫30min
• 4℃ 2000-3000g ,，離心15 min,。
• 用新鮮的血清樣品或分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩ｉL期儲存保存于-70℃,。避免反復(fù)凍融,。
  1. ）制備血漿樣品。

用離心管收集全血樣品到離心管（含終濃度1.735mg/ml K₃EDTA抗凝劑）,，收集后立即離心,。

1. ）如果用肝素抗凝，肝素的用量對實驗結(jié)果的影響,，需提前測定,。
2. ）避免使用溶血樣品或脂血樣品。

1. 樣品的準備

用70ul 1x 稀釋緩沖液稀釋35ul血清樣品,。（推薦使用新鮮的血清樣品）,。

1. 標準品的準備

用前，等體積輕柔混合2X 稀釋緩沖液和重組蛋白（1.024mg/ml）5分鐘,，避免出現(xiàn)氣泡,，直到蛋白溶解?；旌弦海?/span>0.512mg/ml）穩(wěn)定性不超過1天,。

標準品需用1x 稀釋緩沖液，2倍系列稀釋,，起始濃度256 ng/ml ,。每孔100ul。

1. 檢測抗體（HRP標記）的稀釋

用5% 脫脂乳1：500 稀釋檢測抗體,，每孔100ul,。

1. 底物稀釋液

用前1:1 混合顯色液A 和顯色液B。每孔加入100ul,，混合液穩(wěn)定性不超過1天,。

1. 操作程序

A 標準品,、檢測樣品和對照的操作程序

1. 每孔加入100ul 1x IgY捕獲抗體。輕輕封板,，25℃孵育4小時,。
2. 用400ul，1X PBST 洗板一次,。
3. 每孔加入200ul 5% 脫脂乳,。輕輕封板，25℃孵育1小時,。
4. 用400ul,，1X PBST 洗板一次。
5. 每孔加入檢測的血清樣品,、標準品和陰性對照（1x 稀釋緩沖液）100ul到對應(yīng)孔中,，做復(fù)孔。
6. 輕輕封板,，4℃孵育Overnigt。

   B 檢測抗體的應(yīng)用

 1）用400ul,，1X PBST 洗板一次,。

 2) 每孔加入100ul 稀釋后的（1：500）IgY 抗體。

 3）輕輕封板,，25℃孵育1小時,。

C 底物反應(yīng)液

  1）用400ul 1X PBST 洗板3次。

  2）每孔加入100ul 底物混合液,。

  3) 室溫孵育5-20 分鐘,，每孔加入100ul 終止液。

  4）20min內(nèi)讀取450nm OD值,。

  D  結(jié)果

  標準曲線用于確定檢測未知樣品中目的蛋白的含量,。依據(jù)標準品的濃度(X軸)和對應(yīng)的OD（Y軸），做標準曲線,。

  1）計算每個標準品和樣品的平均OD值,。分析結(jié)果前，所有的OD需減去陰性對照（0ng/ml:空白孔）的OD 值,。用OD做縱坐標,，標準品做橫坐標，做標準曲線,。

    2）為了計算每個樣品中目的蛋白的含量,，需讀取檢測樣品的OD值，找到對應(yīng)的X軸樣品濃度值,，讀取樣品濃度,。如果檢測到的樣品濃度,，高于zui高樣品濃度，重新稀釋樣品,，重新做,。zui后依據(jù)標準曲線讀取的樣品濃度 乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品實際濃度,。

    3）樣品實際濃度為標準曲線讀取的樣品濃度 乘以樣品稀釋倍數(shù),，此試劑盒的樣品稀釋倍數(shù)為3。

   標準曲線示意圖

 注：此說明書,，僅供參考,，以英文說明書為準