所有產(chǎn)品僅供科研使用，不能用于食用和醫(yī)療等

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大腸桿菌（ E.coli）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用,。

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料,、糞便和肉類組織（如雞,、牛肉和豬肉）中大腸桿菌（ E.coli）的定

量檢測。

2 實驗原理

本試劑盒采用競爭ELISA 方法,，在微孔板包被有大腸桿菌（ E.coli）偶聯(lián)抗原,，加入

大腸桿菌（ E.coli）標準品或樣品，游離大腸桿菌（ E.coli）與微孔條上預(yù)包被的大腸桿菌

（ E.coli）偶聯(lián)抗原互相競爭抗大腸桿菌（ E.coli）抗體酶標記物,，用TMB 底物顯色,，加

入終止液后顏色由藍色變?yōu)辄S色，用酶標儀在450nm 波長下進行檢測,，吸光值與樣品中大

腸桿菌（ E.coli）含量成反比,，通過標準曲線計算樣品中大腸桿菌（ E.coli）的含量。

大腸桿菌（ E.coli）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒3 試劑盒組成

3.1 預(yù)包被的大腸桿菌（ E.coli）偶聯(lián)抗原的可拆酶標板：1 塊（12 孔×8 條）,。

3.2 大腸桿菌（ E.coli）標準品：6 瓶（1ml/瓶）,，含量分別是： 0 ppb,，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7

ppb,8.1 ppb,。

3.3 抗大腸桿菌（ E.coli）抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）。

3.4 顯色液A：1 瓶（6ml）,。

3.5 顯色液B：1 瓶（6ml）,。

3.6 終止液：1 瓶（6ml），2M 硫酸,。

3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×, 6ml）,，用于樣品稀釋用。

3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×,，20ml）,，用于洗板。

3.9 說明書一份,。

4 需要而未提供的材料

4.1 設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標儀,。

4.1.2粉碎機。

4.1.3量筒,。

4.1.4振蕩器,。

4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙,。

4.1.7微量移液器,。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇。

5 貯存

5.1 試劑盒貯存于2~8℃,，切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

大腸桿菌（ E.coli）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒6 注意事項

6.1 使用試劑盒前請仔細閱讀說明書,。

2

6.2 不要使用過期試劑盒。

6.3 試劑盒使用前,，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，建議至少回溫2小時。

6.4 標準品中含有大腸桿菌（ E.coli）,，使用時應(yīng)特別注意,，操作時應(yīng)帶手套。

6.5 終止液中含有硫酸,，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物,。

6.6 不同標準品、樣品所用吸頭不能混用,，否則會影響試驗結(jié)果,。

6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品,、樣品所用吸頭不得混用,，否則會影響

實驗結(jié)果。

6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,，否則會影響實驗結(jié)果

6.9 混合試劑時應(yīng)避免起泡,。

7 工作液準備

7.1 大腸桿菌（ E.coli）標準品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用

7.3 顯色劑：已備用，避免光線直照

7.4 反應(yīng)終止液：已備用

大腸桿菌（ E.coli）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,，要嚴格按說明書操作,，提取過程中應(yīng)準確稀釋，否則

會出現(xiàn)結(jié)果不準確,，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品,，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25μl處理后的樣品，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實驗須知

9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，時間約2小時,。回溫至室

溫（25±2℃）后再取出微孔條,，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分,，否則影響檢測的精確度和準確度。

9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請不要改變分析程序

9.1.4 請使用精確的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始,，請不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,，請嚴格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染，每個標準品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預(yù)*行編號,，標記B0,、標準品和樣品的位置,，推薦進行雙孔檢測

9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×）,、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）

9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標準品溶液

9.2.5 在各標準孔中加入50μl的標準品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗大腸桿菌（ E.coli）抗體酶結(jié)合物

9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘,。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體,，用洗液洗滌微孔板5次,，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液

3

體。

9.4 反應(yīng)

9.4.1 洗滌程序完成后,，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A,，再加 50μl顯

色液B；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50μl終止液,，混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度,，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。

大腸桿菌（ E.coli）酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒10 結(jié)果計算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標準（0標準）

的吸光度值（B0）再乘以100%,，即百分吸光度值,。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0μg/L標準溶液的平均吸光度值

10.1.2以大腸桿菌（ E.coli）濃度的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸,，繪制標準曲線圖,。

根據(jù)樣品百分吸光度值，可從曲線上得到對應(yīng)點的橫坐標,，即為大腸桿菌（ E.coli）濃度的

對數(shù)值,，求得反對數(shù)即為測定液中大腸桿菌（ E.coli）濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標準曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋

倍數(shù),。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉藴室号c樣品同運行,，根據(jù)樣品與標準品吸光

度值的高低比較，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值,。

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉藴室号c樣品同運行，根據(jù)樣品與標準品顏色

深淺比較,，判斷樣品濃度值是小于還是大于標準值,。

11 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)

大腸桿菌（ E.coli） 100%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.05ppb

B0吸光度*值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％,。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％,。

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試劑盒提供的標準曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證,。

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