所有產(chǎn)品僅供科研使用,，不能用于食用和醫(yī)療等

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李斯特氏菌酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1 使用目的：

本試劑盒用于飼料,、魚,、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉）,，雞蛋,、蜂蜜、牛奶,、血

清和尿樣中李斯特氏菌殘留的定量檢測,。

2 實驗原理

本試劑盒采用競爭ELISA 方法，在微孔板包被有李斯特氏菌偶聯(lián)抗原,，加入李斯特氏

菌標(biāo)準(zhǔn)品或樣品,，游離李斯特氏菌與微孔條上預(yù)包被的李斯特氏菌偶聯(lián)抗原互相競爭抗李斯

特氏菌抗體酶標(biāo)記物，用TMB 底物顯色,，加入終止液后顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色,，用酶標(biāo)儀在

450nm 波長下進(jìn)行檢測，吸光值與樣品中李斯特氏菌含量成反比,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中

李斯特氏菌的含量,。

李斯特氏菌酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒3 試劑盒組成

3.1 預(yù)包被的李斯特氏菌偶聯(lián)抗原的可拆酶標(biāo)板：1 塊（12 孔×8 條）。

3.2 李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)品：6 瓶（1ml/瓶）,，含量分別是： 0 ppb,，0.1 ppb,0.3 ppb,0.9 ppb,2.7 ppb,8.1

ppb。

3.3 抗李斯特氏菌抗體酶結(jié)合物：1 瓶（6ml）,。

3.4 顯色液A：1 瓶（6ml）,。

3.5 顯色液B：1 瓶（6ml）。

3.6 終止液：1 瓶（6ml）,，2M 硫酸,。

3.7 樣本稀釋液：1 瓶（10×, 6ml），用于樣品稀釋用,。

3.8 濃縮洗滌液：1 瓶（20×,，20ml），用于洗板。

3.9 說明書一份,。

4 需要而未提供的材料

4.1 設(shè)備

4.1.1波長450nm酶標(biāo)儀,。

4.1.2粉碎機(jī)。

4.1.3量筒,。

4.1.4振蕩器,。

4.1.5漏斗。

4.1.6Whatman 或相當(dāng)?shù)臑V紙,。

4.1.7微量移液器,。

4.2 試劑

4.2.1去離子水或蒸餾水。

4.2.2 甲醇,。

李斯特氏菌酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒5 貯存

5.1 試劑盒貯存于2~8℃,，切勿冷凍

5.2 未用完的微孔板應(yīng)該密封干燥保存

6 注意事項

6.1 使用試劑盒前請仔細(xì)閱讀說明書。

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6.2 不要使用過期試劑盒,。

6.3 試劑盒使用前,，將試劑恢復(fù)至室溫（25±2℃），建議至少回溫2小時,。

6.4 標(biāo)準(zhǔn)品中含有李斯特氏菌,，使用時應(yīng)特別注意，操作時應(yīng)帶手套,。

6.5 終止液中含有硫酸,，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。

6.6 不同標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品所用吸頭不能混用,，否則會影響試驗結(jié)果。

6.7 不同批號試劑盒中的試劑不得混用,；不同標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響

實驗結(jié)果,。

6.8 稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液,，否則會影響實驗結(jié)果

6.9 混合試劑時應(yīng)避免起泡。

李斯特氏菌酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒7 工作液準(zhǔn)備

7.1 李斯特氏菌標(biāo)準(zhǔn)品溶液：0ppb,0.1ppb,0.3 ppb,0.9ppb,2.7 ppb,8.1ppb

7.2 濃縮洗滌液：用蒸餾水按1:20（1+19）稀釋備用

7.3 樣本稀釋液：用蒸餾水按1:10（1+9）稀釋備用

7.3 顯色劑：已備用,，避免光線直照

7.4 反應(yīng)終止液：已備用

8 樣品處理程序（樣品在提取過程中,，要嚴(yán)格按說明書操作，提取過程中應(yīng)準(zhǔn)確稀釋,，否則

會出現(xiàn)結(jié)果不準(zhǔn)確,，樣品應(yīng)當(dāng)保存在陰涼避光之處及冷藏保存）

8.1取10g粉碎的樣品，加 20ml 70%甲醇溶液

8.2強(qiáng)力振蕩3分鐘

8.3用Whatman 濾紙過濾

8.4取25μl處理后的樣品,，加入25μl樣本稀釋液于反應(yīng)孔中（樣本稀釋倍數(shù)為2）

9 酶免分析步驟

9.1 實驗須知

9.1.1 實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復(fù)至室溫（25±2℃）,，時間約2小時,。回溫至室

溫（25±2℃）后再取出微孔條,，多余的微孔條重新密封立即于2~8℃干燥保存

注：一定保證回溫充分,，否則影響檢測的精確度和準(zhǔn)確度。

9.1.2 使用后請立即將試劑放回2~8℃保存

9.1.3 請不要改變分析程序

9.1.4 請使用精確的微量移液器

9.1.5 操作一旦開始,，請不要中斷任何程序

9.1.6 ELISA結(jié)果的可重復(fù)性極大程度的取決于操作程序,，請嚴(yán)格按照要求操作

9.1.7 為避免交叉污染,，每個標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均應(yīng)使用不同的吸頭加樣

9.1.8 加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內(nèi)表面

9.2 分析步驟

9.2.1 預(yù)*行編號,，標(biāo)記B0、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的位置,，推薦進(jìn)行雙孔檢測

9.2.2 取所需數(shù)量的微孔（微孔條可拆）,，將多余板條重新密封并立即放回2~8℃保存

9.2.3 樣品稀釋液（10×）、濃縮洗滌液（20×）稀釋成工作液（蒸餾水或去離子水稀釋）

9.2.4 在B0孔中加入50μl0.0 ng/ ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.5 在各標(biāo)準(zhǔn)孔中加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)品溶液

9.2.6 在各樣品孔中加入50μl樣品溶液

9.2.7 在所有孔中加入50μl的抗李斯特氏菌抗體酶結(jié)合物

9.2.8 輕輕晃動反應(yīng)板幾秒鐘,。

9.3 37℃溫浴30min （溫浴過程中不時輕拍反應(yīng)板,，可以減少雙孔誤差）

9.3.1 甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板5次,，zui后一次應(yīng)在吸水紙上拍打以*除去孔中液

3

體,。

李斯特氏菌酶聯(lián)免疫分析（ELISA）試劑盒9.4 反應(yīng)

9.4.1 洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入50μl顯色液A,，再加 50μl顯

色液B,；輕微晃動反應(yīng)板使之*混勻

9.4.2 37℃溫浴10min

9.4.3 每孔中加入50μl終止液，混勻

9.4.4 在450nm下檢測吸光度,，結(jié)果在5min內(nèi)讀取,。

10 結(jié)果計算

10.1定量分析

10.1.1所獲得的每個濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以*個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）

的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值,。

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

10.1.2以李斯特氏菌濃度的對數(shù)值為X軸,，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,。根據(jù)樣品

百分吸光度值,，可從曲線上得到對應(yīng)點(diǎn)的橫坐標(biāo)，即為李斯特氏菌濃度的對數(shù)值,，求得反對

數(shù)即為測定液中李斯特氏菌濃度C（ppb）

10.1.3由于樣品經(jīng)過了預(yù)先稀釋,，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度一定要再乘以其稀釋

倍數(shù)。

10.2 半定量測定

10.1.1目測半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品吸光

度值的高低比較,，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值。

10.1.2儀器半定量測定：首先選擇一個適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)液與樣品同運(yùn)行,，根據(jù)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色

深淺比較,，判斷樣品濃度值是小于還是大于標(biāo)準(zhǔn)值,。

11 特異性

物質(zhì) 交叉反應(yīng)

李斯特氏菌 100%

12 試劑盒參數(shù)

本試劑盒檢測下限為0.05ppb

B0吸光度*值應(yīng)大于1.0

試劑盒吸光度板內(nèi)誤差小于8％，板間誤差小于15％,。

用本說明書提供的組織樣本提取方法回收率大于80％,。

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試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.1ppb~8.1ppb。

14 分析限制

本試劑盒檢測為陽性的樣品應(yīng)該用另一種方法如HPLC或GC/MS加以確證,。

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