一,、實驗目的

   1,、學習克隆工作中zui常用的雙酶切,； 2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術,； 3,、學習氯化鈣法制備大腸桿菌(Escherichia coli)感受態(tài)細胞的技術,； 4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義,。 5,、外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。 6,、學習鑒定重組子的方法,。

二、 實驗原理

   重組子的建立：采用雙酶切質粒載體pBR322和pUC18,，酶切后產生了互補的粘性末端,，在T4 DNA 連接酶的作用下，兩個質粒片段連接,。 感受態(tài)細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl,，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化,，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態(tài)細胞(competent cell) ,。
    轉化（transformation）：是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段,，是基因工程(Genetic Engineering)等研究領域的基本實驗技術,。

   電轉化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞,。

   克隆的篩選：主要用不同抗生素(antibiotic)基因篩選,。常用的抗生素(antibiotic)有：氨芐青霉素、卡那霉素,、氯霉素,、四環(huán)素、鏈霉素等,；

   重組質?？寺〉蔫b定：鑒定帶有重組質粒克隆的方法常用的有α-互補,、小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析,、插入失活、PCR以及雜交篩選的方法,。

   zui常用的方法是小規(guī)模制備質粒DNA進行酶切分析,，對于帶有LacZ基因的載體還可以結合α-互補現象來篩選。

三,、試劑與器材

   1,、試劑 pUC18質粒，pBR322質粒，DL2000 Marker, Pst I(15U/ul)及酶切緩沖液, EcoR I(15U/ul)及酶切緩沖液,，DNA Ligation Kit Ver 2.1 (TaKaRa),，LB液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani) ，LB固體培養(yǎng)基,，50mg/ml卡那霉素(kanamycin)儲存液,，質粒快速提取試劑盒（博大泰克）,，10 X Buffer K,， Pst I，EcoR I (TaKaRa) 2,、器材 電基因轉移議,，恒溫搖床，臺式高速離心機,，恒溫水浴鍋,， 瓊脂糖凝膠電泳裝置，電熱恒溫培養(yǎng)箱,，電泳儀,，超凈工作臺， 微量移液槍,，eppendorf管,。

四、操作方法

   1．構建重組質粒 質粒pUC18和pBR322分別用Pst I和EcoR I雙酶切,，將酶切產物按照1：1的比例混合,，使用T4 DNA連接酶連接，構建成重組質粒,。 2．制備感受態(tài)大腸桿菌(Escherichia coli)細胞 收集大腸桿菌(Escherichia coli)細胞,，采用CaCl2 處理，制備成感受態(tài)細胞,。 3．重組子的轉化 將構建的重組質粒加入到制備的感受態(tài)細胞懸浮液中,，電擊法將重組質粒轉化到宿主細胞中。 4．重組子的篩選鑒定 采用藍白篩選重組子,。酚快速抽提質粒,，酶切后電泳鑒定。

五,、關鍵步驟與注意事項

   2．連接反應溫度選擇要適中,，過高粘末端之間形成氫鍵不穩(wěn)定，過低會影響連接酶的活性,。 3．連接反應兩種質粒的比例為1：1,，否則容易自連,。 4．制備感受態(tài)細胞時要采用對數生長期初期的細胞，低溫處理時間要足夠,。 5．電擊法時電擊電壓、電流,、時間選擇要合適,。 6．轉化及藍白篩選要作陰、陽性對照,，防止出現假陽性,、假陰性。