豬流行性腹瀉病毒IgA抗體ELISA試劑盒

（此說明書僅供參考,，以包裝內(nèi)英文說明書為準(zhǔn)?。,。?/span>

1,、疾病概況

PEDV屬于冠狀病毒科，可以使任何年齡段的豬出現(xiàn)嚴(yán)重的小腸炎,，初生仔豬容易死亡,。這個(gè)病的癥狀與TGEV相似。

在歐洲和中國已受該病的傳播影響,。1969年在歐洲爆發(fā)過此病毒的大流行,。在1969年前，收集的豬血清中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的抗體,。從那時(shí)開始,，該病已向歐洲多個(gè)國家蔓延,，嚴(yán)重的爆發(fā)則較少發(fā)生。在大型的養(yǎng)殖場里,，病毒持續(xù)留在斷奶和失去母源抗體免疫力的仔豬體內(nèi),。在這些場里，病毒可能與斷奶腹瀉有關(guān),。病毒的傳播主要通過豬的直接接觸傳染和接觸病毒污染物的間接傳染,。

PED的研究癥狀包括厭食、嘔吐,、腹瀉和脫水,。在5日齡以下的感染豬由于發(fā)生嚴(yán)重的腹瀉和脫水，發(fā)病率和死亡率為100%,；而大于10日齡的染病豬的發(fā)病率和死亡率為10%,。

該病肉眼可見的病變是小腸邊緣的絨毛變短作為主要特征，與TGE的病變相似,。結(jié)腸無病變,。

2、試劑盒的介紹

從生物試劑母豬的初乳中檢測PED IgA抗體的試驗(yàn),，對PED的防控有很大的意義,。韓國安捷公司的PED IgA抗體ELISA試劑盒含有已經(jīng)包被好PED IgA抗原的微孔酶標(biāo)板。檢測時(shí),，包被抗原的酶標(biāo)板與稀釋好的血清孵育,，然后與羊抗豬的IgA-HRP酶標(biāo)物反應(yīng)。孵育后,，在加入底物前用清洗液將沒有結(jié)合的物質(zhì)清洗干凈,。反應(yīng)結(jié)合的酶跟孔中乳汁的PED IgA抗體的量成正比例。加入終止液結(jié)束反應(yīng),，用酶標(biāo)儀在456nm和620nm雙波長條件下,，讀取結(jié)果。

3,、試劑盒組成

1）抗原包被好的酶標(biāo)板5塊

2）陰性對照：1ml1瓶

3）陽性對照：1ml1瓶

4）樣品稀釋液：80ml1瓶

5）20倍濃縮的清洗液：250ml1瓶

6）101倍濃縮的酶標(biāo)物：1ml1瓶

7）酶標(biāo)稀釋液：80ml1瓶

8）底物A：40ml1瓶

9）底物B：40ml1瓶

10）終止液：80ml1瓶

11）封板膜10塊

12）說明書1份

4,、注意事項(xiàng)

為了得到重復(fù)性好的結(jié)果，建議必須遵循以下規(guī)定,。

1）只用于體外診斷,。

2）不同批號的試劑不能混合。

3）使用干凈的玻璃器皿,，不準(zhǔn)使用生銹的金屬容器,。

4）接觸潛在感染物和實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，必須使用一次性手套,。

5）使用底物和終止液時(shí)要小心,，避免讓液體接觸皮膚,、眼睛和粘膜。如果不慎沾上,，應(yīng)立即用自來水沖洗,。

5、樣品收集和保存

1）從生物試劑的母豬身上采集乳汁樣本,。

2）如果樣本不是馬上進(jìn)行檢測的,，請保存在2~8℃的環(huán)境中。要保存時(shí)間超過3天的,，請將樣品保存在-20℃或更低的溫度環(huán)境中,。使用前，請把樣品放到室溫環(huán)境進(jìn)行回溫,。

3）出現(xiàn)沉淀物的樣品會使結(jié)果不一致,，該樣品不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

6、試劑的準(zhǔn)備

1）使用前,，將試劑盒的所有試劑回復(fù)到室溫,。

2）不用稀釋陰,、陽性對照液和樣品,。

3）準(zhǔn)備酶標(biāo)物（101倍濃縮）：使用前，必須將酶標(biāo)物按1:100進(jìn)行稀釋,。（10ul的酶標(biāo)物加入1ml的酶標(biāo)物稀釋液中進(jìn)行稀釋,。）

4）清洗液的準(zhǔn)備（20倍濃縮）：使用前，必須將清洗液按1:19進(jìn)行稀釋,。如果洗液出現(xiàn)結(jié)晶物,，請將洗液放在37℃處，加熱數(shù)分鐘即可溶解結(jié)晶物,。（10ml清洗液加入190ml的純凈水中進(jìn)行稀釋,。）

5）底物的準(zhǔn)備：使用前，將底物A和底物B按1:1混合,。為了得到更好的檢測結(jié)果,，在使用前，底物溶液要達(dá)到20~25℃,，或培養(yǎng)30分鐘,。

7、操作步驟

1）準(zhǔn)備好用于樣品稀釋的酶標(biāo)板,。在每個(gè)微孔中加入100ul的樣品稀釋液,。

2）陰、陽性對照液個(gè)2個(gè)孔,，其余各孔為樣品孔,。

加入10ul的陰性對照液于A1和B1孔

加入10ul的陽性對照液于C1和D1孔

其余各孔加入10ul樣品

3）用封板膜把反應(yīng)孔蓋好,，然后輕輕地振蕩酶標(biāo)板。此步驟對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性是很重要的,。

4）在37℃下,，孵育60分鐘。

5）用已稀釋好的清洗液洗板5次,，每次350ul,。zui后一次洗板后，要將板里的水扣干凈,。

6）每孔加入100ul酶標(biāo)物,。

7）在37℃下，孵育30分鐘,。

8）用已稀釋好的清洗液洗板5次,，每次350ul。zui后一次洗板后,，要將板里的水扣干凈,。

9）每孔加入100ul底物。

10）18～25℃下,，孵育15分鐘,。

11）每孔加入100ul終止液終止反應(yīng)。

12）用酶標(biāo)儀,，在450nm和620nm雙波長的條件下,，讀取吸光值。必須在30分鐘內(nèi),，完成讀取結(jié)果,。讀取結(jié)果時(shí)，酶標(biāo)板內(nèi)不能出現(xiàn)氣泡,。

8,、檢測分析

1）檢測的有效性

①　陰性對照的平均OD值<0.200

②　陽性對照的平均OD值>0.500

③　如果上述其中一個(gè)值超出了規(guī)定的范圍，則該實(shí)驗(yàn)被視為無效,。所檢的樣品需要重新進(jìn)行檢測,。

2）計(jì)算判斷值

①　用A1和B1孔的吸光值來計(jì)算陰性對照的平均OD值。

判斷值＝（0.35＋陰性對照的平均OD值）

②　根據(jù)陰性對照的OD值,，樣品結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：

-陽性結(jié)果：樣品OD值>判斷值

-陰性結(jié)果：樣品OD值<判斷值

③　舉例：

陰性對照平均OD值：0.078

判斷值＝0.35＋0.078＝0.428

樣品OD值為0.389：樣品為陰性

樣品OD值為0.894：樣品為陽性

9,、局限性和干擾性

1）檢測步驟，注意事項(xiàng)和對結(jié)果的判定必須嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,。

2）采樣：

①　樣品中所含有的*,，對測試結(jié)果沒有影響。

②　巴氏滅菌法（60℃條件下不少于10小時(shí)）消毒過的樣品可能導(dǎo)致活性減弱，故而不可用于檢測,。

③　加熱滅活的樣品（56℃,，30分鐘）并不影響試驗(yàn)結(jié)果。

④　抗凝血劑如肝素,，EDTA,，檸檬酸鹽不會影響試驗(yàn)結(jié)果。

⑤　溶血的樣品應(yīng)在使用前離心,，以免被細(xì)胞內(nèi)成分干擾,。

⑥　含有脂肪酶或黃疸的樣品并不影響檢測結(jié)果。

3）操作規(guī)程中樣品加入失敗,，將會引起錯(cuò)誤的結(jié)果,，如有研究上有任何疑似PRRS病毒感染癥狀，建議重復(fù)檢驗(yàn),。

10,、保存條件

所有試劑都要保存在2～8℃的環(huán)境中。

11,、穩(wěn)定性

1）不要使用過期的試劑盒

2）準(zhǔn)備的試劑的穩(wěn)定性