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當(dāng)前位置:上海信帆生物科技有限公司>>技術(shù)文章>>上海信帆生物:有絲分裂(Feulgen染色法)
實驗原理:細胞中的DNA受1NHC1,,60℃水解作用以后,,核酸中的嘌呤堿很快*被除掉,,使脫氧核糖中潛在的醛基獲得自由狀態(tài),。水解后,,組織要經(jīng)水洗再移至希夫(Schiff)試劑中,希夫試劑即同露出來的醛基發(fā)生反應(yīng),,呈現(xiàn)紫紅色,。這個反應(yīng)是Feulgen在1942年提出來的,是DNA的一個特異性檢查法,。
水解的時間很重要,,因為核酸的水解有兩個過程,,*,漂呤堿很快被除掉,,脫氧核糖中潛在的醛基顯露出來,,第二,組蛋白和核酸愈來愈多地被除掉,。在短時間的水解作用以后,,*個過程占優(yōu)勢,這時候用希夫試劑染色,,染色體的染色作用zui強,。隨著水解作用的繼續(xù)進行,第二個過程逐漸變成優(yōu)勢,,因此水解液中的希夫反應(yīng)增強,,而染色體中的希夫應(yīng)減弱。zui后,,第二個過程超過*過程時,,染色體也隨之停止反應(yīng)。
希夫試劑是堿性品紅———亞硫酸溶液,,呈無色,。與DNA醛基反應(yīng)后,使堿性品紅恢復(fù)原來的紅色,。
二,、實驗?zāi)康模河^察蠶豆根尖細胞或其它根尖細胞內(nèi)染色體中的DNA,以及染色體在有絲分裂中的行為,,掌握Feulgen染色方法,。
三、實驗材料:上次實驗制成了石蠟切片,。
四,、實驗準(zhǔn)備:
1.用具 立式染色缸一套,鑷子,,蓋玻片,,小漏斗,鐵架,,毛邊紙,,玻璃棒,顯微鏡,,恒溫水浴鍋,,溫度計,燒杯,,棕色瓶,,黑紙,。
2.玻璃器皿的清洗 主要是染色缸的清洗,一般用肥皂粉洗,,用水沖凈即可,,如不能洗凈時,,要用洗液浸泡后,,再沖洗,自來水洗后,,再用少量蒸餾水過洗一次,。盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必須干燥,,缸蓋內(nèi)緣必須涂以幾士林,,以防止蒸發(fā)和收水分,影響濃度,。染色缸上要貼上標(biāo)簽,。
3.實驗所需藥口及配制
濃鹽酸(36—38%),堿性品紅,,偏重亞硫酸鈉(Na2S2O5);
亞硫酸鈉(Na2SO3),固綠(fast green),,加拿大中性樹膠乙醇(30—100%),二甲苯,。
藥品配制:
1各種濃度的乙醇配制.
21NHCI配制:取濃HCI 82.5毫升加蒸餾水至1000毫升,,搖勻。
3Sciff 試劑的配制
0.5克堿性品紅,,加到已經(jīng)煮沸的100毫升蒸餾水中,,再煮沸3—4分鐘,待溶液冷卻到50℃時過濾,,再等溶液冷到25℃以下時,,加入10毫升的1NHCI和1。5克偏重亞硫酸鈉,,裝在棕色瓶中,,塞緊瓶子,用黑紙包好,,放在暗處,,第二天觀察,溶液還是淡紅色就不能用,,只得重配,。
偏重亞硫酸鈉與1NHCI反應(yīng),放出SO2,,SO2與堿性品紅反應(yīng),,生成堿性品紅--亞硫酸溶液,,呈無色。
4漂染液的配制
先配10%的亞硫酸鈉溶液,。
把10%亞硫酸鈉溶液10毫升加200毫升蒸餾水,,再加10毫升1NHCI,即成漂當(dāng)液,。
5固綠染色液
0.5克固綠溶于100毫升95%乙醇溶液,。
五、實驗步驟:
水解 先在恒溫水浴箱中準(zhǔn)備好恒溫60℃的1NHCI,。注意一定要控制好溫度不能過高,,高了醛基要破壞,低了小解不充分,,醛基不能釋放出來,。水解的時間長短要根據(jù)材料,以及固定液的種類而定,。根據(jù)試驗結(jié)果,,取一個適當(dāng)時間。
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