本文討論的范圍包括RNA酶保護分析,，northernblot，原位雜交,，半定量RT-PCR和定量RT-PCR,。本文不談具體protocol，是因為各種書籍和kit說明書上都有,，主要說一些原則,，而且大部分是失敗和成功的經(jīng)驗，還有小組討論結(jié)果以及各種書里七零八落看的內(nèi)容,，希望對大家有用,。

基因表達的定義：說到基因表達，是指RNA,，還是蛋白,？是指mRNA還是包括風頭正旺的非編碼RNA,？mRNA還有不翻譯的RNA呢。應(yīng)該說轉(zhuǎn)錄水平指的是RNA水平,，而蛋白應(yīng)該叫翻譯水平,？我們這里就特指編碼蛋白的mRNA的量的檢測吧！ 

方法：很多很多,，我們常用的也就是RT-PCR和northern,。RNA沒保護分析在國外很常用，也有半定量的功能,，一次性試劑盒還能以此將一個表達簇一起分析,，例如NFkB的轉(zhuǎn)錄激活譜中的8個常見基因。dot blot的zui大貢獻是發(fā)展到了反向dot blot的――曾經(jīng)無*髦的基因芯片,，而原位雜交的放大效應(yīng)和它的假陽性使它的定量（半定量,，應(yīng)該根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意義不可同日而語,，又難做,，只有新發(fā)現(xiàn)的基因可以在沒有得到蛋白和抗體的情況下進行組織或者細胞定位。

先談?wù)凴T-PCR吧,。關(guān)于原位雜交和 dot blot大家可以和我論戰(zhàn)的,，我曾經(jīng)看到一篇公開發(fā)表的文章把dot blot稱為定量檢測，是錯誤的,。

1,、模板均一性問題：愚見采用從RNA定量的方法似不妥，不要說PCR的本身的敏感度,，即便是在反轉(zhuǎn)錄就有差異,，到了cDNA的分裝和用于模板的取樣，這些都不能保證準確,，當然在反轉(zhuǎn)錄階段我們也經(jīng)?？刂圃?或5ug，但這是為了再將來加樣的時候保證大致差不多,，而且盡可能地利用反轉(zhuǎn)錄酶,，而且RNA定量本身即使用電泳也不是那么準，更不要說分光光度計,，這里說一下,，我曾經(jīng)看到有人說用分光光度計定量，這也不是很準確,，分光光度計只是掌握大概,，當然用于反轉(zhuǎn)錄足夠了，但是用于rt－pcr的定量這是不正確的,，很不準的,，RNA也至少要用電泳,，一方面定量，另一方面可以看看完整性,。至于用分光光度計比較不同標本之間就更不準了,。 

2、RNA制備：一般制備總RNA 即可,，有時需要制備mRNA,，個人認為初學者還是選擇Trizol，大量制備采用傳統(tǒng)的方法自己配,，實際上和trozol一樣的,，有時效果還好，trizaol也就是混一混,，但是優(yōu)點在于質(zhì)量保證,，使用方便，效率高,，根據(jù)不同組織用trizol一般可以提到全部RNA的50%（別小看,，這已經(jīng)很高了）以上，有些可以到達80%,。mRNA用Qiagen的柱子，別去自己做Oligo（dT）柱,，太麻煩,。是否用DNAseI根據(jù)基因的特點和引物的設(shè)計，能夠跨內(nèi)含子的就不需要處理,，處理還是很危險的哦,。像這樣的微量和也用不了多少次的實驗，并且如果牽涉到樣品是*的時候,，因該選好的進口試劑,。談到RNA的貯存實際上主要是溫度，至于放在TRIZOL中是不可取的,，更不要說在胍里了,，只－20是不夠的，至少－80,，液氮zui保險,，想想，在低溫里,，即使加上些RNA酶它也降解不了哇,！qiagen出了一種easy產(chǎn)品可用于保存標本，但在常溫也只是1天,，所以低溫才是首要的,，抽的時候也是這樣,。 

3、反轉(zhuǎn)錄：常規(guī),，取樣盡量一致,，如上所述，不是為了定量,，是為了半定量PCR時圖形的好看,。選擇逆轉(zhuǎn)錄酶根據(jù)實驗需要，少量的可用 Promega的一種1ug的酶,，多的我們用invitrgen的5ug的II,，當然有人說Promega和Roche的也不錯，用過,，的確可以,，要不 Invitrogen不像當初Gibco時那么牛了，也降價打折了,。反轉(zhuǎn)錄成功后就不必太小心了,，放在那里都可以，想想你還曾經(jīng)72度滅活呢,，是不是,？要知道，雜合雙鏈比DNA雙鏈還穩(wěn)定的,。一般來說要擴增從反轉(zhuǎn)錄到PCR全過程的長達2kb以上的片斷是相當困難的事,，很多長基因是通過隨機引物庫得到的而不是通過oligo （Td）得到的，不要說反轉(zhuǎn)錄,即使是PCR也是很困難的,，不信可以從質(zhì)粒里試試,至于反轉(zhuǎn)錄,，就更是天方夜譚了，除了酶的效率等,還有RNA的二級結(jié)構(gòu)等因素,，這就要一些大公司的特殊的名貴的效果也未必好的酶了,，Ｒoche和Invitrogen都有的.聽天由命吧。

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