信帆生物為您分享：MTT實驗zui全指南

一,、MTT是什么

MTT是一種粉末狀化學試劑,，全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4,，5-二甲基噻唑-2)-2,，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍,。是一種黃顏色的染料,。

二、mtt法用來做什么

簡單地說：是一種檢測細胞存活和生長的方法,。

MTT主要有兩個用途

1.藥物(也包括其他處理方式如放射線照射)對體外培養(yǎng)的細胞毒性的測定;

2.細胞增殖及細胞活性測定,。

三、為何MTT可以用來做上述工作

檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(Formazan)并沉積在細胞中,，而死細胞無此功能,。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的甲瓚，用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值,，在一定細胞數(shù)范圍內,，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)成正比,。根據(jù)測得的吸光度值(OD值)，來判斷活細胞數(shù)量,，OD值越大,，細胞活性越強(如果是測藥物毒性，則表示藥物毒性越小),。

四,、實驗所需材料

1.MTT 溶液的配制 通常MTT 配成的終濃度為5mg/ml,須用PBS或生理鹽水做溶劑。

市面上一般MTT的包裝為100mg,250mg或1g

1.1對于100mg這樣的小包裝,，廠家都是將MTT放入小管中的,，個人建議不要再用天平稱量分裝，而應該一次性將其全配制成溶液,，如100mg用20mlPBS來溶解,。 具休做法：預先在50ml離心管(沒有的話，可用培養(yǎng)瓶替代)加入20ml PBS,，從中先吸取500-1000ul PBS裝入含MTT的小管中,，吹打若干次后將其移入50ml離心管，然后再混勻,?？梢灾貜蛶状危允剐」苤械腗TT不殘留于管內,。將MTT*混勻后,，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液里的細菌，分裝避光(避光袋或是黑紙,、錫箔紙包住)可長期保存于-20度,。按細胞培養(yǎng)板每孔需加10ul計算，一般每96孔板約需1ml,，所以分裝時可考慮每管分裝1ml,。

1.2對于大包裝，可按上述方法稱取一部分溶解,，也有人將粉劑分裝在EP管里,，用的時候現(xiàn)配，直接往培養(yǎng)板中加,。

注意事項：

l在配制和保存的過程中,，容器用鋁箔紙包住。

l配成的MTT需要無菌,，MTT對菌很敏感

lMTT一般現(xiàn)用現(xiàn)配,，過濾后4度避光保存兩周內(個人曾做過4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不錯)有效,，或配制成5mg/ml保存在-20度長期保存,，避免反復凍融,，小劑量分裝，用避光袋或是黑紙,、錫箔紙包住避光以免分解,。當MTT變?yōu)榛揖G色時就不能再用。

lMTT有致癌性,，用的時候小心,有條件帶那種透明的簿膜手套.

2.MTT甲瓚溶解液

2.1二甲基亞砜DMSO,，可以直接溶解，無需配制,，使用方便,，溶解速度快，但對人體毒性較大,，且需去除原培養(yǎng)液,，在去除培養(yǎng)液的過程中，可能會把結晶去掉,，導致結果不穩(wěn)定,。

2.2三聯(lián)溶解液：SDS10g，異丁醇5ml,，10M HCl 0.1ml 用雙蒸水溶解配成100ml溶液(文獻方法：周建軍等,，評價抗癌物質活性的改良MTT方法，中國醫(yī)藥工業(yè)雜志,，1993,，24(10)：455-457)，該溶解液不需去除原培養(yǎng)基,，但溶解較慢,。(個人覺得其溶解的能力不如DMSO強)

該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶,，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫，將SDS結晶全部溶解后再使用,。

五,、MTT法實驗步驟

1: 胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集,，制成細胞懸液,，細胞計數(shù)調整其濃度至5-10×104/ml。

細胞詳細計數(shù)方法請參照易生物實驗技術中的相關文章,。

對于初學者而言,，要使細胞達到5-10×104/ml往往不知從何處著手，我在這里向大家提供一個簡單的方法以初步確定細胞數(shù)量,。

以一般細胞培養(yǎng)常用的25cm2為例,，

1)細胞密度在長到約80%~90%(下圖所示為80%~90%密度時細胞的大致狀態(tài)),，消化離心收集后，將上清去掉,，加入3ml培養(yǎng)基使其混勻,。

2)另取一支新的15ml無菌離心管(為下一步接種96孔板用)，裝入約9ml培養(yǎng)基.

3)從*步準備的3ml細胞懸液中取1ml, 加入上管,，混勻后細胞計數(shù),，此時一般為或小于5-10×104/ml，該濃度相當于細胞計數(shù)板4個大格內每大格平均5-10個細胞(見下圖);如果不夠該濃度,，再根據(jù)計數(shù)的結果滴加細胞懸液,，每滴按50ul計算。

4)細胞數(shù)量因實驗目的不同應做相應調整,，如一般細胞增殖實驗每孔2000個就可以(相當于細胞懸液密度為2×104/ml),，細胞毒性實驗每孔5000—10000個(相當于細胞懸液密度為5×104/ml)。此外,，還應根據(jù)細胞本身特性,，如生長快慢，來決定細胞數(shù)量,。比如：生長較快的細胞密度可略小,。

2.將細胞懸液制備好后，輕輕混勻,，每孔加入100ul, 這樣待測細胞的密度為5000—10000/孔(邊緣孔用無菌PBS填充),。

l注意：因細胞在混勻后仍要繼續(xù)沉降，因此接種的過程中要反復多次混勻,，如每加6個孔就混勻一次,，以確保接種的細胞密度在各孔之間*相同，這對于MTT的結果至關重要,。

3.將接種好的細胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥,，或兩小時,，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板,，次日上午加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.建議設6個,，否則難以反應真實情況。下圖可做為96孔板的的參考步局,。

l對于加藥,，有人直接將藥物按不同體積加入到96孔板中，以形成濃度梯度。但本人認為應盡量在EP管中將不同濃度的藥物配好,，然后將96孔板中的培養(yǎng)上清去掉(可以用排槍吸走)再加入100ul含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,，這樣能保證藥物濃度的準確。另外,，需注意的是,，如果用這種方法，不要把96孔板的培養(yǎng)液全部吸走后再加藥,，應該吸完一部分后立即加樣,，避免由于96孔板干燥引起細胞死亡。

4.5%CO2,，37℃孵育16-48小時,，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果。下圖為一典型的藥物梯度為細胞的毒性作用,。

5.每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml,，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h,。若藥物與MTT能夠反應,，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后,，再加入含MTT的培養(yǎng)液,。

6. 終止培養(yǎng)，準備溶解結晶,。

l 溶解結晶的方法有兩種,，*種，用DMSO溶解

1) MTT加入培養(yǎng)4h后,，結晶可充分形成,。將上清去掉，該過程要注意不能把Formazan結晶移走,。有人直接用移液器將上清移走,，也有人建議先鋪幾張濾紙在桌面，然后將96孔板輕輕倒置,，這樣上清便被濾紙吸走,，以減少結果的損失。個人認為,，這兩種方法都有可能導致結晶的損失，從而引起結果的不準確,。采用哪種方法,，可以自己摸索一下再決定。

2) 每孔加入150ul二甲基亞砜,，置搖床上低速振蕩10min,，使結晶物充分溶解,。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值。

l 另一種方法,，用三聯(lián)溶解液(見上面MTT甲瓚溶解液)

1) MTT加入培養(yǎng)4h后,，結晶可充分形成。這種方法細胞上清可以不用去掉,，直接在每孔加入100ul溶解液,。(該溶解液因含有SDS，在低溫保存的時候易產生結晶,，因此在用之前必須提前幾小時拿至室溫,，將SDS結晶全部溶解后再使用。)

2) 放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4—6小時,，鏡下觀察,，待結晶全部溶解后570nm測吸光度。通常37℃孵育4小時左右,，紫色結晶會全部溶解,。如果紫色結晶較小較少，溶解的時間會短一些,。如果紫色結晶較大較多,，溶解的時間會長一些。

在實際的操作過程中,，往往為了等待4—6小時,，使得實驗者在下班以后或者晚上來測OD值，給實驗者帶來了很大的不方便,。個人曾經摸索,，加入溶解液后過一夜再測對OD值基本無影響，但要注意的是一定要避光,，不過培養(yǎng)箱關閉后本身就是閉光的,，所以加入溶解液后放入培養(yǎng)箱中，第二天上班時再測OD值就可以了,。

7,、同時設置調零孔(培養(yǎng)基、MTT,、二甲基亞砜),，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質,、培養(yǎng)液,、MTT、二甲基亞砜)。

六,、MTT結果分析

關于如何計算IC50

1,、改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg zui大劑量

I:lg(zui大劑量/相臨劑量)

P:陽性反應率之和

Pm:zui大陽性反應率

Pn:zui小陽性反應率

舉個例子：各藥物濃度作用于某腫瘤細胞后所得MTT值如下

藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125 0
OD均值
0.080 0.093 0.236 0.374 0.441 0.531 0.614
公式中的zui大zui小陽性反應率就是zui大zui小抑制率

抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值，如對于100ug/ml的藥物,，其抑制率=1-0.080/0.614=0.869,，各組抑制率如下：

藥物濃度ug/ml
100 50 25 12.5 6.25 3.125
抑制率
0.869 0.849 0.616 0.391 0.282 0.135
代入計算公式：

Pm=0.869

Pn=0.135

P=0.869+0.849+0.616+0.391+0.282+0.135=3.142

Xm=lg100=2

lgI=lg100/50=0.301

lgIC50=2-0.301*(3.142-(3-0.869-0.135)/4)=1.655

IC50=45.186

該藥物的IC50值為45.186ug/ml