檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確,，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化,，方法是western blot。雖然,，順利的時(shí)候Western Blot做起來(lái)很簡(jiǎn)單,，可不順的時(shí)候也很令人心煩――做不出結(jié)果啦,、假陽(yáng)性啦,、結(jié)果出現(xiàn)多條帶啦、到底是一抗有問(wèn)題還是二抗有問(wèn)題啦……畢竟，作為一種有活性的生物大分子,，抗體和抗原的反應(yīng)畢竟不象1+1那么明確,，而用這種不確定的試劑來(lái)測(cè)定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實(shí)是有一定的不確定性的,。所以,，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern Blot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有用的,。

我們知道,，要用Western Blot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,，前提條件是等量的細(xì)胞上樣,，才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí),，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析,。艾美捷向您推薦使用內(nèi)參抗體來(lái)檢測(cè)您的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，或者校準(zhǔn)您的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,。內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),，對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins)，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物,。在Western Blotting中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá),，由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信,。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常,。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單：如果樣品蛋白量有限,，只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量,。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析,，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果,。如果樣品量充分，可以先檢測(cè)內(nèi)參,，觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致,，根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn),，至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致，即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析,。這樣雖然麻煩一點(diǎn),，但是可以保證結(jié)果更有說(shuō)服力，更可信,。畢竟我們的實(shí)驗(yàn)是一種嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓ぷ鳌?/p>

常用的細(xì)胞總蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin,，這其中zui近的國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道中使用GAPDH內(nèi)參的較多。對(duì)于一些植物的樣本,，則需要特別的植物Actin蛋白作為內(nèi)參;同樣的,，如果提取的樣本是細(xì)胞核蛋白，那么PCNA或者組蛋白H3都是被經(jīng)常使用的;而針對(duì)一些研究線粒體的客戶,，那么Cox IV則被較多的文獻(xiàn)引用作為線粒體總蛋白的內(nèi)部參考,。