信帆生物代做凝膠遷移電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）,，咨詢,！

一 探針的標(biāo)記

1 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

(1)待標(biāo)記探針(1.75 pmol/微升)：2微升。

(2)T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X)：1微升,。

(3)Nuclease-Free Water：5微升,。

(4)[γ-32P]atp(3 000 Ci/mmol at 10 mCi/ml)：1微升,。

(5)T4 Polynucleotide Kinase(5-10 u/微升)：1微升,。

(6)總體積10微升。

(7)按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑,，加入同位素后,，Vortex混勻，再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻,。

2 使用水浴或PCR儀,，37℃反應(yīng)10分鐘。

3 加入1微升探針標(biāo)記終止液,，混勻,，終止探針標(biāo)記反應(yīng)。

4 再加入89微升TE,混勻,。此時(shí)可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率,。通常標(biāo)記的效率在30%以上，即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上,。為實(shí)驗(yàn)簡便起見,，通常不必測定探針的標(biāo)記效率。

5 標(biāo)記好的探針立即使用,，zui長使用時(shí)間一般不宜超過3天,。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃。

二 探針的純化

通常為實(shí)驗(yàn)簡便起見,，可以不必純化標(biāo)記好的探針,。在有些時(shí)候，純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果,。如需純化,，可以按照如 下步驟操作：

1 對于100微升標(biāo)記好的探針，加入1/4體積即25微升的5 M醋酸銨,，再加入2體積即200微升的無水乙醇,，混勻。

2 在-70℃至-80℃沉淀1小時(shí),，或在-20℃沉淀過一夜,。

3 在4℃,，12 000 g-16 000 g離心30分鐘。小心去除上清,，切不可觸及沉,。

4 在4℃，12 000 g-16 000 g離心1分鐘,。小心吸去殘余液體,。微晾干沉淀，但不宜過分干燥,。

5 加入100微升TE,*溶解沉淀,。標(biāo)記好的探針立即使用，zui長使用時(shí)間一般不宜超過3天,。標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃,。

三 EMSA 膠的配制

1 準(zhǔn)備好倒膠的模具?？梢允褂贸Ｒ?guī)的灌制蛋白電泳膠的模具,，或其它適當(dāng)?shù)哪＞摺＿x擇可以灌制較薄膠的模具,，以便于干膠等后續(xù)操作,。為得到更好的結(jié)果，可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具,。

2 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大),。

(1)TBE buffer(10X)：1毫升。

重蒸水 16.2毫升,。

(2)39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w)：2毫升,。

(3)80甘油：625微升。

(4)10% 過硫酸銨(ammonium persulfate)：150微升,。

(5)TEMED：10微升,。

按照上述次序加入各個(gè)溶液，加入TEMED前先混勻,，加入TEMED后立即混勻,，并馬上加入到制膠的模具中。避免產(chǎn)生氣泡,， 并加上梳齒,。如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡，可以把一塊制膠的玻璃板進(jìn)行硅烷化處理,。

四 EMSA結(jié)合反應(yīng)

1. 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng),。

1.1 陰性對照反應(yīng)：

(1)Nuclease-Free Water :7微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)：2微升,。

(3)細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：0微升,。

(4)標(biāo)記好的探針：1微升,。

(5)總體積：10微升。

1.2 樣品反應(yīng)：

(1)Nuclease-Free Water ：5微升,。

(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)：2微升,。

(3)細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

(4)標(biāo)記好的探針：1微升,。

(5)總體積：10微升,。

1.3 探針冷競爭反應(yīng)：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升。

(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)：2微升,。

(3)細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升,。

(4)未標(biāo)記的探針：1微升。

(5)標(biāo)記好的探針：1微升,。

(6)總體積：10微升,。

1.4 突變探針的冷競爭反應(yīng)：

(1)Nuclease-Free Water ：4微升,。

(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)：2微升,。

(3)細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

(4)未標(biāo)記的突變探針：1微升,。

(5)標(biāo)記好的探針：1微升,。

(6)體積：10微升。

1.5 Super-shift反應(yīng)：

(1)Nuclease-Free Water：4微升,。

(2)EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X)：2微升,。

(3)細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子：2微升。

(4)目的蛋白特異抗體：1微升,。

(5)標(biāo)記好的探針：1微升,。

(6)總體積 :10微升。

2 按照上述順序依次加入各種試劑,，在加入標(biāo)記好的探針前先混勻,，并且室溫(20-25℃)放置10分鐘，從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,，或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng),。然后加入標(biāo)記好的探針，混勻,，室溫(20-25℃)放置20分鐘,。

3 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色，10X),，混勻后立即上樣,。注意：有些時(shí)候溴酚藍(lán)會影響蛋白和DNA的結(jié)合，建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液,。如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時(shí)感覺到無法上樣,，可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍(lán)色的上樣緩沖液,，至能觀察到藍(lán)顏色即可。

五 電泳分析

1 用0.5XTBE作為電泳液,。按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘,。預(yù)電泳的時(shí)候如果有空余的上樣孔，可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍(lán)色),，以觀察電壓是否正常進(jìn)行,。

2 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi)。在多余的某個(gè)上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液 (藍(lán)色),，用于觀察電泳進(jìn)行的情況,。

3 按照10 V/厘米的電壓電泳。確保膠的溫度不超過30℃,，如果溫度升高,，需要適當(dāng)降低電壓。電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍(lán)色染料溴酚藍(lán)至膠的下緣1/4處,，停止電泳,。

4 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實(shí)的濾紙。小心取下夾有EMSA膠的膠板,，用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊 緣的電壓液,。小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板)，把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個(gè)EMSA膠,，輕輕把濾紙和膠壓緊,。濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘)，輕輕揭起濾紙,，這時(shí)EMSA膠會被濾紙一起揭起來,。把濾紙側(cè)向下，放平,，在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,，確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡。

5 干膠儀器上干燥EMSA膠,。然后用X光片壓片檢測,，或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測。