聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction PCR)是一種體外擴(kuò)增特異性DNA片段的技術(shù),。它可以在體外特異地對目的基因進(jìn)行大量擴(kuò)增,，其巧妙之處在預(yù)先設(shè)計(jì)合成二段分別與待測目的基因二端互補(bǔ)的引物,，以起到指向定點(diǎn)的作用,；再借助于DNA聚合酶催化的若干次擴(kuò)增反應(yīng)后，即可使特定的基因片段成百萬倍的擴(kuò)增,。擴(kuò)增反應(yīng)分三步：
①變性：當(dāng)通過加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA,。
②褪火：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多,，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈,，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少,。
③延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的條件下,，
以引物為起始點(diǎn),，從5′→3′催化的DNA鏈延伸反應(yīng)。
以上3步為一個(gè)循環(huán),，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一循環(huán)的模板,，若干次循環(huán)之后，介于兩個(gè)引物之間的特異性DNA片段就得到了大量的復(fù)制,，數(shù)量可達(dá)2×107～8拷貝,，PCR的實(shí)驗(yàn)操作包括模板DNA(或RNA)的制備、引物的設(shè)計(jì)合成,、酶促聚合反應(yīng),、反應(yīng)產(chǎn)物的檢測等。
操作步驟
(一)模板DNA(靶序列)的制備
進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板可以是人體組織細(xì)胞的染色體DNA,，微生物的DNA,，或是由mRNA反轉(zhuǎn)錄而成的cDNA等。本實(shí)驗(yàn)用小鼠肝臟制備染色體DNA作為PCR擴(kuò)增的模板,。
1. 取肝組織0.5g加入2ml裂解液,。
2. 冰浴勻漿。
3. 取勻漿液200μl加入裂解液200μl,。
4. 加入蛋白酶k至終末濃度為100μg/ml,。
5. 以上溶液在65℃保溫?cái)?shù)小時(shí)或過一夜，不時(shí)震搖,。
6. 加入75μl 8M KAC,，混勻。
7. 在4℃放置15分鐘,。
8. 加入750μl氯仿,。
9. 經(jīng)充分震搖后5 000rpm、離心5分鐘,，將上清液轉(zhuǎn)入一新的Eppenderf管,，沉淀?xiàng)壢ァ?br />10. 加入750μl無水乙醇,，充分混勻,，-20℃靜置30分鐘,。
11. 12 000rpm、離心10分鐘,，棄去上清,，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm,、再離心5分鐘,，棄去上清，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘,，使痕量乙醇揮發(fā),。
12. 將DNA沉淀團(tuán)塊溶于100μl TE緩沖液，加RNA酶1μl,，在37℃水浴放置30分鐘,。
13. 用等體積的酚/氯仿抽提一次。
14. 取上清,，加入1/10體積的NaAc(pH4.8)和2倍體積的無水乙醇,，混勻。
15. 12 000rpm,、離心10分鐘,，棄去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次,，10 000rpm,，再離心5分鐘，棄去上清,，于室溫將有DNA沉淀的Eppendorf管敞開15～30分鐘,，使痕量乙醇揮發(fā)。溶于50μl TE,。
16. 取1μl樣品用500μl雙蒸水稀釋,，在260nm和280nm處測定吸光度。鑒定樣品純度并計(jì)算其含量,。
17. 將DNA溶液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>