細胞凍存液的作用及操作！

細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。利用凍存技術(shù)將細胞置于-196℃液氮中低溫保存,，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來，這樣在需要的時候再復(fù)蘇細胞用于實驗,。而且適度地保存一定量的細胞,，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種，起到了細胞保種的作用,。除此之外,，還可以利用細胞凍存的形式來購買、寄贈,、交換和運送某些細胞,。 細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑--終濃度5%．15%的甘油或二甲基亞砜(DMSO)，可使溶液冰點降低,，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成,，從而避免細胞損傷,。
原理：

細胞冷凍的原理在于盡可能降低細胞內(nèi)的晶體形成，減少細胞內(nèi)水凝固所形成的高濃度溶質(zhì)對細胞造成的低溫損傷,，從提高細胞復(fù)蘇時的存活率,。細胞凍存的數(shù)量應(yīng)保證復(fù)蘇時低溫保護劑獲得1:10～1:20的稀釋，稀釋后的細胞濃度扔高于正常傳代的細胞濃度為宜,，這是因為當(dāng)?shù)蜏乇Ｗo劑稀釋10～20倍以后,，該濃度一般不會對細胞造成毒性損傷,。

操作步驟：

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液,；

2. 取對數(shù)生長期的細胞,，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗,。

3. 去除PBS,，加入適量胰蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細胞消化下來；

4. 離心1000rpm,，5min,；

5. 去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液,，用吸管輕輕吹打使細胞均勻,，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml,；

6. 將細胞分裝入凍存管中,，每管1～1.5 ml；

7. 在凍存管上標明細胞的名稱,，凍存時間及操作者,；

8. 凍存：標準的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達-25℃以下時,，可增至-5℃～-10℃/min,；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中,。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ,，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管,，移入液氮容器內(nèi),。

注意事項：

1．從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養(yǎng)細胞都可以用于凍存，但最好為對數(shù)生長期細胞,。

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時,，要做好防護工作，以免凍傷,；

3．最好用新配制的培養(yǎng)液,。