JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位，以及檢測(cè)線粒體膜電位的操作步驟,！

線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1 法)(Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1)是一種以 JC-1 為熒光探針,，快速靈敏地檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位變化的試劑盒,，可以用于早期的細(xì)胞凋亡檢測(cè),，CCCP 作為誘導(dǎo)線粒體膜電位下降的陽(yáng)性對(duì)照。該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域,，不宜用于研究診斷或其他用途,。

產(chǎn)品組成：

操作步驟(僅供參考)：

1、配制 JC-1 染色工作液：

取適量 JC-1 Stain (200×),，按照每 50μl JC-1 Stain (200×)加入 8ml ddH₂O 的比例稀釋 JC-1,，劇烈 Vortex 充分溶解并混勻 JC-1 Stain。然后再加入 2ml JC-1 Buffer(5×),，

混勻后即為 JC-1 染色工作液,。6 孔板每孔所需 JC-1 染色工作液的量為 1ml，其它培養(yǎng)器皿的 JC-1 染色工作液的用量以此類推,；對(duì)于細(xì)胞懸液每 0.5～1.0×10⁶ 細(xì)胞需 0.5ml JC-1 染色工作液,。

2、設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照：

推薦 CCCP(10mM)按照 1:1000 的比例加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中,，稀釋至 10μM,，處理細(xì)胞20min。隨后按照下述方法裝載 JC-1,，進(jìn)行線粒體膜電位的檢測(cè),。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞，通常 10μM CCCP 處理 20min 后線粒體的膜電位會(huì)*喪失,，JC-1 染色后觀察應(yīng)呈綠色熒光,；而正常的細(xì)胞經(jīng) JC-1 染色后應(yīng)顯示紅色熒光。對(duì)于特定的細(xì)胞,，CCCP 的作用濃度和作用時(shí)間可能有所不同,，需自行參考相關(guān)文獻(xiàn)資料確定,。

3、對(duì)于懸浮細(xì)胞：

• 取 1～6×10⁵ 細(xì)胞,，重懸于 0.5ml 細(xì)胞培養(yǎng)液中,，細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含血清和酚紅。

• 加入 0.5ml JC-1 染色工作液,，顛倒數(shù)次混勻,。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min。

• 在孵育期間,，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例,，配制適量的 JC-1 Buffer(1×)，并放置于冰浴,。

• 37℃孵育結(jié)束后,， 4℃ 600g 離心 3～4min，沉淀細(xì)胞,。棄上清,，注意盡量不要吸除細(xì)胞。

• 用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次：加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細(xì)胞,，4℃ 600g 離心3～4min,，沉淀細(xì)胞，棄上清,。再加入 1ml JC-1 Buffer(1×)重懸細(xì)胞,，4℃ 600g 離心

3～4min，沉淀細(xì)胞,，棄上清,。

• 再用少量 JC-1 Buffer(1×)重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察,，也可以用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)或流式細(xì)胞儀分析,。

JC-1法檢測(cè)線粒體膜電位，以及檢測(cè)線粒體膜電位的操作步驟,！

4,、對(duì)于貼壁細(xì)胞：

注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，如果希望采用熒光分光光度計(jì)或流式細(xì)胞儀檢測(cè),，應(yīng)先收集細(xì)胞,，重懸后參考懸浮細(xì)胞的檢測(cè)方法。

• 吸除 6 孔板培養(yǎng)液,，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)如有必要可以用 PBS 或其它適當(dāng)溶液洗滌細(xì)胞一次,，加入 1ml 細(xì)胞培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。

• 加入 1ml JC-1 染色工作液,，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃孵育 20min,。

• 在孵育期間,，按照每 1ml JC-1 Buffer(5×)加入 4ml 蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1 Buffer(1×),，并放置于冰浴,。

• 37℃孵育結(jié)束后，吸除上清,，用 JC-1 Buffer(1×)洗滌 2 次,。

• 加入 2ml 細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅,。

• 熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察,。

5、對(duì)于純化的線粒體：

• 把配制好的 JC-1 染色工作液再用 JC-1 Buffer(1×)稀釋 5 倍,。

• 0.9ml JC-1 染色工作液中加入 0.1ml 總蛋白量為 10～100μg 純化的線粒體,。

• 用熒光分光光度計(jì)或熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)：混勻后直接用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行時(shí)間掃描，激發(fā)波長(zhǎng)為 485nm,，發(fā)射波長(zhǎng)為 590nm,。如果使用熒光酶標(biāo)儀，激發(fā)波長(zhǎng)不能設(shè)置為 485nm 時(shí),，可以在 475～520nm 范圍內(nèi)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng),。另外，也可以參考下面步驟 6

中的波長(zhǎng)設(shè)置進(jìn)行熒光檢測(cè),。 d. 用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察：方法同下面的步驟 6,。

6、熒光觀測(cè)和結(jié)果分析：

檢測(cè) JC-1 單體時(shí)可以把激發(fā)光設(shè)置為 490nm,，發(fā)射光設(shè)置為 530nm,；檢測(cè) JC-1 聚合物時(shí)，可以把激發(fā)光設(shè)置為 525nm,，發(fā)射光設(shè)置為 590nm,。注意：此處測(cè)定熒光時(shí)不必把激發(fā)光和發(fā)射光設(shè)置在zui大激發(fā)波長(zhǎng)和zui大發(fā)射波長(zhǎng)。如使用熒光顯微鏡觀察,，檢測(cè) JC-1 單體時(shí)可以參考觀察其它綠色熒光時(shí)的設(shè)置,，如觀察 GFP 或 FITC 時(shí)的設(shè)置；檢測(cè) JC-1 聚合物時(shí)可以參考觀察其它紅色熒光,，如碘化丙啶或 Cy3 時(shí)的設(shè)置,。出現(xiàn)綠色熒光說(shuō)明線粒體膜電位下降，并且該細(xì)胞很可能處于細(xì)胞凋亡早期。出現(xiàn)紅色熒光說(shuō)明線粒體膜電位比較正常,，細(xì)胞的狀態(tài)也比較正常,。

注意事項(xiàng)：

1、 JC-1 Stain(200×)應(yīng)*溶解混勻后使用,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。必須先把 JC-1 用 ddH₂O 充分溶解混勻后，才可加入 JC-1 Buffer(1×),。不可先配制 JC-1 Buffer(1×)再加入

JC-1 Stain(200×),，否則導(dǎo)致 JC-1 很難充分溶解，嚴(yán)重影響后續(xù)的檢測(cè),。

2,、 對(duì)于 6 孔板中的樣品，本試劑盒共可以檢測(cè) 100 個(gè)樣品,；對(duì)于 12 孔中的樣品,，本試劑盒共可以檢測(cè) 200 個(gè)樣品。

3,、 裝載完 JC-1 后用 JC-1 Buffer(1×)洗滌時(shí),，盡量使 JC-1 Buffer(1×)保持 4℃左右，此時(shí)的洗滌效果較好,。

4,、 JC-1 探針裝載完并洗滌后盡量在 30min 內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)，在檢測(cè)前需冰浴保存,。

5,、 勿把 JC-1 Buffer(5×)全部配制成 1×，因?yàn)椴僮鬟^(guò)程中需直接使用 JC-1 Buffer(5×),。6,、 如 JC-1 Buffer(5×)中有沉淀，必須全部溶解后才能使用,，為促進(jìn)溶解可以在 37℃加熱,。7、 CCCP 為線粒體電子傳遞鏈抑制劑,，有一定毒性,，請(qǐng)注意小心防護(hù)。

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