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塵封20年的秘密：從溶血病理機制研究到抗體藥物研發(fā)
幾十年來,，科學家們一直致力于研究溶血對器官的損傷作用，但仍未完全發(fā)現驅動這種病理現象的內在機制,。
近期,，來自美國圣裘德兒童醫(yī)院的研究人員在Cell上發(fā)表了題為“NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs”的文章[1]，尋找到一種先天免疫模式識別受體NLRP12,，是誘導炎癥細胞死亡和病理的關鍵分子,。
值得注意的是，在文章中,，Incucyte® 實時活細胞分析系統(tǒng)顯著地推動了這項研究,，并承擔了整個實驗約80%的工作量，成為構筑論文主體的關鍵工具,。那么,，文章是如何應用Incucyte® 的呢？
先天免疫是由病原體,、病原相關分子模式（PAMP）或損傷相關分子模式（DAMP）激活引起的,，增強的免疫激活可導致細胞損傷、組織破壞和器官損傷,，以及DAMP的釋放（圖1）,。模式識別受體（PPR）因其可以感知非特異性PAMP或DAMP的能力而被經典研究，然而,，多種PAMP和DAMP對PRR的聯(lián)合激活尚未得到很好的表征,。
圖1. 紅細胞破裂、DAMP釋放,、聯(lián)合PAMP激發(fā)下游信號通路導致細胞死亡
萬事開頭難,，研究人員首先需要建立體外模擬感染并驅動先天免疫和炎癥細胞死亡的模型。如圖2所示，研究人員選擇多種DAMP,、PAMP及其組合的誘導細胞死亡的分子,，以骨髓源性巨噬細胞(BMDM)為模型，應用Incucyte® 檢測（圖2）,，結果顯示：單獨的PAMP Pam3,、poly(I:C)、LPS或R848處理骨髓源性巨噬細胞(BMDM),，觸發(fā)死亡比例低,。然而，組合PAMP在許多組合中都會誘導大量細胞死亡（圖2）,。同樣,，單個DAMP不會誘導BMDM中的細胞死亡，DAMP的組合也不會誘導細胞死亡,。PAMP與DAMP的組合中血紅素與Pam3,、LPS或R848的組合細胞死亡反應強烈。由此表明,，由特定PAMP組合驅動的信號傳導以及血紅素與PAMP的組合可以誘導強烈的細胞死亡,。
圖2. 各種誘導劑組合的細胞死亡代表性圖片以及定量圖；Incucyte® 可以自動獲取48小時內PI染色的圖像,，允許明場和熒光通道的重疊,，并標記陽性信號，通過設定分析閾值和背景扣除算法,，自動定量分析PI陽性細胞的比例
遵循圖1的研究路線,，接下來的任務是通過干擾中間受體和信號分子，來探究是否能改變細胞死亡的表型,。在這一步驟中,，Incucyte® 的高通量自動成像和分析功能將全面支持本文的研究，全程自動記錄并分析細胞死亡的比例,。
Incucyte® 不僅可檢測常規(guī)細胞死亡,，使用特殊活細胞檢測試劑，還可檢測線粒體ROS產生,。血紅素暴露通過產生活性氧(ROS)觸發(fā)巨噬細胞中的細胞死亡,。血紅素加PAMP刺激導致BMDM中線粒體ROS(mitoROS)的產生（圖3AB）。使用ROS清除劑N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)進行處理可顯著防止細胞死亡（圖3C）,，表明ROS產生與誘導細胞死亡之間存在機制聯(lián)系,。
圖3. (A) ROS熒光及明場代表性圖片由Incucyte® 直接導出；(B) Incucyte® 計算紅色熒光強度值,；(C) NAC消除劑可防止細胞死亡
在這篇文章中，無論是測試病原相關分子模式（PAMP）,、損傷相關分子模式（DAMP）及其組合對細胞死亡的影響,，還是后續(xù)干擾中間信號分子以觀察細胞死亡情況,，都涉及到濃度和時間點的精準控制。這時,，Incucyte® 的實時監(jiān)測功能就大顯神威了,，它可以實時檢測并確定細胞死亡的最高時間點和最佳濃度，顯著降低實驗工作量,，提高科研效率,。
每當我推薦Incucyte® 時，總會問一個問題：這臺設備能實現什么其他設備無法做到的?這篇文章可能就是答案,。
科研工作常常是在最后的20%時間獲取80%的結果,，大部分時間都處于探索和摸索階段。而Incucyte® 的優(yōu)勢便是能大幅度縮短這一探索階段的時間,。
這項新研究確定NLRP12在誘導炎癥細胞死亡質膜破裂從而致病的關鍵因子,，那么其作為藥物靶標，可有效減少器官損傷,。接下來,，讓我們看另一篇文章是如何直接利用基礎機制設計抗體藥物，來接抑制程序性細胞死亡的質膜破裂進而減弱炎癥反應,，削弱病理損傷的,。
關于細胞質膜破裂（PMR）有一個有趣的觀點轉變。過去的觀點認為,，PMR是一個由滲透壓變化引起的被動過程,，細胞是“脹”破的；然而,，這個觀點在21年被推翻了,。進一步研究表明：質膜破裂及LDH和DAMP的釋放需要一種名為NINJ1的蛋白參與，如果該蛋白發(fā)生突變,，PMR就不會發(fā)生,。因此，我們是否能夠通過抑制NINJ1來限制過度細胞死亡的質膜破裂呢,？
Kayagaki等人在Nature發(fā)表題為“Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury”的文章,，證實了之前提出的設想，即使用NINJ1抗體可以抑制程序性細胞死亡的質膜破裂[2],。
為了生產NINJ1阻斷抗體,，使用全長NINJ1對NinJ1−/−小鼠免疫接種，分離15000個IgM陰性-B細胞,，對篩選到的217種重組抗小鼠NINJ1 IgG2a單克隆抗體進行功能篩選,，確定clone D1（Ninj1-575）是NINJ1依賴性PMR的抑制劑（圖4A）。同時，clone D1抑制了HEK293T細胞中小鼠NINJ1（而非人NINJ1）異位表達引起的膜損傷（圖4B）,。
圖4.(A) NINJ1阻斷抗體篩選及生產流程,；
圖4.(B) 阻斷抗體D1抑制異位表達導致的膜損傷，Incucyte® 實時檢測分析每半小時YOYO+細胞比例
之后,，研究人員又使用FITC標記的150kDa dextran導入BMDM細胞作為工具,，當質膜破裂，熒光信號消失,。與同種型對照抗體相比,，克隆D1以劑量依賴性方式降低BMDM中的PMR，克隆25表現出質膜破裂阻斷活性,，但不如克隆D1有效（圖5）,。
圖5. Incucyte® 每半小時檢測一次DD150陽性細胞比例，質膜破裂的細胞為陰性細胞,，藍色為Clone D1曲線,，0.1μg/ml濃度就能達到很好的抑制效果。
本研究為從基礎研究向臨床轉化提供了一種高效的研究策略框架,。在確定導致疾病的關鍵病因后,，尋求阻斷策略便是首要任務。對于細胞表面分子,，最直接的策略便是利用專一抗原的抗體來抑制其作用,。在這個過程中，可以利用iQue® 高通量流式細胞儀在短短5分鐘內完成96孔板的B細胞篩選,。同時,，在抗體生產過程中，親和力和濃度是最關鍵的兩點,，Octet® 非標記分子互作系統(tǒng)的檢測可以提供精準信息,。最后，驗證抗體效果時,，我們會使用Incucyte®,，該設備能夠實時監(jiān)測細胞的增殖和死亡等指標。
為什么如此多CNS文章選用Incucyte® 來進行活細胞成像實驗呢,？
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長時程,，不閑置：培養(yǎng)箱內可長達數周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔自動拍攝,，減少人力,，防止過多操作對細胞的傷害
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通量高，通用性強：6個板位,，分別獨立設置檢測程序,，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿,；
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智能化拍攝，AI分析：高效簡便的模塊化軟件設置和數據分析,，輸出圖片,、視頻、生長曲線等多指標多參數,；
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完整解決方案：大于100種優(yōu)化過的活細胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol,；文章數大于14,000篇,，是長時間活細胞成像產品
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多種應用的配套拍攝模式：針對3D類器官/腫瘤球、線粒體膜電位,、神經突,、血管生成等應用都有配套的拍攝及分析模式
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-參考文獻-
[1] NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs. Cell. 2023 Jun 22;186(13):2783-2801
[2] Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury. Nature. 2023 Jun;618(7967):1072-1077.