幾十年來(lái)，科學(xué)家們一直致力于研究溶血對(duì)器官的損傷作用,，但仍未完全發(fā)現(xiàn)驅(qū)動(dòng)這種病理現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制,。
近期，來(lái)自美國(guó)圣裘德兒童醫(yī)院的研究人員在Cell上發(fā)表了題為“NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs”的文章[1],，尋找到一種先天免疫模式識(shí)別受體NLRP12,，是誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞死亡和病理的關(guān)鍵分子。
值得注意的是,，在文章中,，Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)顯著地推動(dòng)了這項(xiàng)研究，并承擔(dān)了整個(gè)實(shí)驗(yàn)約80%的工作量,，成為構(gòu)筑論文主體的關(guān)鍵工具,。那么，文章是如何應(yīng)用Incucyte® 的呢,？
先天免疫是由病原體,、病原相關(guān)分子模式（PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（DAMP）激活引起的，增強(qiáng)的免疫激活可導(dǎo)致細(xì)胞損傷,、組織破壞和器官損傷,，以及DAMP的釋放（圖1）。模式識(shí)別受體（PPR）因其可以感知非特異性PAMP或DAMP的能力而被經(jīng)典研究,，然而,，多種PAMP和DAMP對(duì)PRR的聯(lián)合激活尚未得到很好的表征。
圖1. 紅細(xì)胞破裂,、DAMP釋放,、聯(lián)合PAMP激發(fā)下游信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞死亡
萬(wàn)事開頭難,，研究人員首先需要建立體外模擬感染并驅(qū)動(dòng)先天免疫和炎癥細(xì)胞死亡的模型。如圖2所示,，研究人員選擇多種DAMP、PAMP及其組合的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的分子,，以骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDM)為模型,，應(yīng)用Incucyte® 檢測(cè)（圖2），結(jié)果顯示：單獨(dú)的PAMP Pam3,、poly(I:C),、LPS或R848處理骨髓源性巨噬細(xì)胞(BMDM)，觸發(fā)死亡比例低,。然而,，組合PAMP在許多組合中都會(huì)誘導(dǎo)大量細(xì)胞死亡（圖2）。同樣,，單個(gè)DAMP不會(huì)誘導(dǎo)BMDM中的細(xì)胞死亡,，DAMP的組合也不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。PAMP與DAMP的組合中血紅素與Pam3,、LPS或R848的組合細(xì)胞死亡反應(yīng)強(qiáng)烈,。由此表明，由特定PAMP組合驅(qū)動(dòng)的信號(hào)傳導(dǎo)以及血紅素與PAMP的組合可以誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞死亡,。
圖2. 各種誘導(dǎo)劑組合的細(xì)胞死亡代表性圖片以及定量圖,；Incucyte® 可以自動(dòng)獲取48小時(shí)內(nèi)PI染色的圖像，允許明場(chǎng)和熒光通道的重疊,，并標(biāo)記陽(yáng)性信號(hào),，通過(guò)設(shè)定分析閾值和背景扣除算法，自動(dòng)定量分析PI陽(yáng)性細(xì)胞的比例
遵循圖1的研究路線,，接下來(lái)的任務(wù)是通過(guò)干擾中間受體和信號(hào)分子,，來(lái)探究是否能改變細(xì)胞死亡的表型。在這一步驟中,，Incucyte® 的高通量自動(dòng)成像和分析功能將全面支持本文的研究,，全程自動(dòng)記錄并分析細(xì)胞死亡的比例。
Incucyte® 不僅可檢測(cè)常規(guī)細(xì)胞死亡,，使用特殊活細(xì)胞檢測(cè)試劑,，還可檢測(cè)線粒體ROS產(chǎn)生。血紅素暴露通過(guò)產(chǎn)生活性氧(ROS)觸發(fā)巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞死亡,。血紅素加PAMP刺激導(dǎo)致BMDM中線粒體ROS(mitoROS)的產(chǎn)生（圖3AB）,。使用ROS清除劑N-乙酰L-半胱氨酸(NAC)進(jìn)行處理可顯著防止細(xì)胞死亡（圖3C），表明ROS產(chǎn)生與誘導(dǎo)細(xì)胞死亡之間存在機(jī)制聯(lián)系,。
圖3. (A) ROS熒光及明場(chǎng)代表性圖片由Incucyte® 直接導(dǎo)出,；(B) Incucyte® 計(jì)算紅色熒光強(qiáng)度值,；(C) NAC消除劑可防止細(xì)胞死亡
在這篇文章中，無(wú)論是測(cè)試病原相關(guān)分子模式（PAMP）,、損傷相關(guān)分子模式（DAMP）及其組合對(duì)細(xì)胞死亡的影響,，還是后續(xù)干擾中間信號(hào)分子以觀察細(xì)胞死亡情況，都涉及到濃度和時(shí)間點(diǎn)的精準(zhǔn)控制,。這時(shí),，Incucyte® 的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)功能就大顯神威了，它可以實(shí)時(shí)檢測(cè)并確定細(xì)胞死亡的最高時(shí)間點(diǎn)和最佳濃度,，顯著降低實(shí)驗(yàn)工作量,，提高科研效率。
每當(dāng)我推薦Incucyte® 時(shí),，總會(huì)問(wèn)一個(gè)問(wèn)題：這臺(tái)設(shè)備能實(shí)現(xiàn)什么其他設(shè)備無(wú)法做到的?這篇文章可能就是答案,。
科研工作常常是在最后的20%時(shí)間獲取80%的結(jié)果，大部分時(shí)間都處于探索和摸索階段,。而Incucyte® 的優(yōu)勢(shì)便是能大幅度縮短這一探索階段的時(shí)間,。
這項(xiàng)新研究確定NLRP12在誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞死亡質(zhì)膜破裂從而致病的關(guān)鍵因子，那么其作為藥物靶標(biāo),，可有效減少器官損傷,。接下來(lái)，讓我們看另一篇文章是如何直接利用基礎(chǔ)機(jī)制設(shè)計(jì)抗體藥物,，來(lái)接抑制程序性細(xì)胞死亡的質(zhì)膜破裂進(jìn)而減弱炎癥反應(yīng),，削弱病理?yè)p傷的。
關(guān)于細(xì)胞質(zhì)膜破裂（PMR）有一個(gè)有趣的觀點(diǎn)轉(zhuǎn)變,。過(guò)去的觀點(diǎn)認(rèn)為,，PMR是一個(gè)由滲透壓變化引起的被動(dòng)過(guò)程，細(xì)胞是“脹”破的,；然而,，這個(gè)觀點(diǎn)在21年被推翻了。進(jìn)一步研究表明：質(zhì)膜破裂及LDH和DAMP的釋放需要一種名為NINJ1的蛋白參與,，如果該蛋白發(fā)生突變,，PMR就不會(huì)發(fā)生。因此,，我們是否能夠通過(guò)抑制NINJ1來(lái)限制過(guò)度細(xì)胞死亡的質(zhì)膜破裂呢,？
Kayagaki等人在Nature發(fā)表題為“Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury”的文章，證實(shí)了之前提出的設(shè)想,，即使用NINJ1抗體可以抑制程序性細(xì)胞死亡的質(zhì)膜破裂[2],。
為了生產(chǎn)NINJ1阻斷抗體，使用全長(zhǎng)NINJ1對(duì)NinJ1−/−小鼠免疫接種，分離15000個(gè)IgM陰性-B細(xì)胞,，對(duì)篩選到的217種重組抗小鼠NINJ1 IgG2a單克隆抗體進(jìn)行功能篩選,，確定clone D1（Ninj1-575）是NINJ1依賴性PMR的抑制劑（圖4A）。同時(shí),，clone D1抑制了HEK293T細(xì)胞中小鼠NINJ1（而非人NINJ1）異位表達(dá)引起的膜損傷（圖4B）,。
圖4.(A) NINJ1阻斷抗體篩選及生產(chǎn)流程；
圖4.(B) 阻斷抗體D1抑制異位表達(dá)導(dǎo)致的膜損傷,，Incucyte® 實(shí)時(shí)檢測(cè)分析每半小時(shí)YOYO+細(xì)胞比例
之后,，研究人員又使用FITC標(biāo)記的150kDa dextran導(dǎo)入BMDM細(xì)胞作為工具，當(dāng)質(zhì)膜破裂,，熒光信號(hào)消失,。與同種型對(duì)照抗體相比,，克隆D1以劑量依賴性方式降低BMDM中的PMR,，克隆25表現(xiàn)出質(zhì)膜破裂阻斷活性，但不如克隆D1有效（圖5）,。
圖5. Incucyte® 每半小時(shí)檢測(cè)一次DD150陽(yáng)性細(xì)胞比例,，質(zhì)膜破裂的細(xì)胞為陰性細(xì)胞，藍(lán)色為Clone D1曲線,，0.1μg/ml濃度就能達(dá)到很好的抑制效果,。
本研究為從基礎(chǔ)研究向臨床轉(zhuǎn)化提供了一種高效的研究策略框架。在確定導(dǎo)致疾病的關(guān)鍵病因后,，尋求阻斷策略便是首要任務(wù),。對(duì)于細(xì)胞表面分子，最直接的策略便是利用專一抗原的抗體來(lái)抑制其作用,。在這個(gè)過(guò)程中,，可以利用iQue® 高通量流式細(xì)胞儀在短短5分鐘內(nèi)完成96孔板的B細(xì)胞篩選。同時(shí),，在抗體生產(chǎn)過(guò)程中,，親和力和濃度是最關(guān)鍵的兩點(diǎn)，Octet® 非標(biāo)記分子互作系統(tǒng)的檢測(cè)可以提供精準(zhǔn)信息,。最后,，驗(yàn)證抗體效果時(shí)，我們會(huì)使用Incucyte®,，該設(shè)備能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的增殖和死亡等指標(biāo),。
為什么如此多CNS文章選用Incucyte® 來(lái)進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/strong>
長(zhǎng)時(shí)程，不閑置：培養(yǎng)箱內(nèi)可長(zhǎng)達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察,，最短幾分鐘間隔自動(dòng)拍攝,，減少人力，防止過(guò)多操作對(duì)細(xì)胞的傷害
通量高，通用性強(qiáng)：6個(gè)板位,，分別獨(dú)立設(shè)置檢測(cè)程序,，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿；
智能化拍攝,，AI分析：高效簡(jiǎn)便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析,，輸出圖片、視頻,、生長(zhǎng)曲線等多指標(biāo)多參數(shù),；
完整解決方案：大于100種優(yōu)化過(guò)的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol,；文章數(shù)大于14,000篇,，是長(zhǎng)時(shí)間活細(xì)胞成像產(chǎn)品
多種應(yīng)用的配套拍攝模式：針對(duì)3D類器官/腫瘤球、線粒體膜電位,、神經(jīng)突,、血管生成等應(yīng)用都有配套的拍攝及分析模式
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-參考文獻(xiàn)-
[1] NLRP12-PANoptosome activates PANoptosis and pathology in response to heme and PAMPs. Cell. 2023 Jun 22;186(13):2783-2801
[2] Inhibiting membrane rupture with NINJ1 antibodies limits tissue injury. Nature. 2023 Jun;618(7967):1072-1077.
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