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“膜” 法學(xué)院之基礎(chǔ)篇,，如何選擇合適的濾膜,！
據(jù)研究只有10%不到的人真正會(huì)用超濾管？
回收效率低下,，目標(biāo)蛋白滲漏...
有的時(shí)候真懷疑自己可能用了一個(gè)假超濾管,。
今天賽多利斯的“膜”法學(xué)院就來把超濾管使用過程中的干貨仔細(xì)篩一篩，助實(shí)驗(yàn)室大神一臂之力,！
關(guān)于“膜” 法學(xué)院之基礎(chǔ)篇——來自于“爺爺奶奶” 輩的超濾產(chǎn)品
作為世界上個(gè)商業(yè)化生產(chǎn)膜產(chǎn)品的企業(yè),，賽多利斯的膜可是有91年的歷史了。賽多利斯的膜源于曾經(jīng)在賽多利斯公司附近的哥廷根大學(xué)任職的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主Richard Adolf Zsigmondy的發(fā)明,，和大多數(shù)歷史悠久的德國產(chǎn)品一樣,，工藝和質(zhì)量嚴(yán)謹(jǐn)是賽多利斯秉承多年的家風(fēng),。那么，關(guān)于“膜”,，有哪些基本知識(shí)是經(jīng)常被大家忽略的呢,？
選對(duì)截留分子量，事半功倍
你是否抱怨過超濾管流速慢呢,？很有可能是截留分子量選小啦,！
超濾膜并非均一孔徑的膜，因此超濾膜截留分子量MWCO是標(biāo)稱值,，例如對(duì)分子量100kD左右的球蛋白截留＞90%的膜而被標(biāo)稱為100kD。所以,，如果用標(biāo)稱為100kD的膜去截留我們自己100kD的樣品很有可能無法達(dá)到較高的截留效果,。所以建議大家選擇的超濾膜MWCO是需要截留的目標(biāo)分子量的1/6-1/2。如果首先考慮流速的因素,，則選擇需要截留的目標(biāo)分子量的1/2作為膜的截留分子量,；如果截留效果作為主要考慮，則選擇需要截留的目標(biāo)分子量的1/5或1/6作為膜的截留分子量,。另外,，由于膜的特性不一樣，更換品牌或是同品牌不同產(chǎn)品系列時(shí),，適合的截留分子量偶爾是會(huì)變化的,！這點(diǎn)一定要多加注意呀！另外,，即使是相同的截留分子量,，不同的膜的流速是不一樣的，所以,，選擇較高流速的膜,，例如PES膜，可以讓實(shí)驗(yàn)更加輕松,。
另外,，有小伙伴是做核酸和病毒的，如果想用超濾的方法來濃縮怎么操作呢,？這個(gè)大可以放心,！可以參考下表來進(jìn)行選擇和試驗(yàn)：
Membrane | MWCO | Double-Stranded Nucleotide Cutoff (bp) |
Hydrosart® | 2 kDa | > 10 |
Hydrosart® | 10 kDa | > 30 |
Hydrosart® | 30 kDa | > 50 |
Hydrosart® | 50 kDa | > 300 |
Hydrosart® | 100 kDa | > 600 |
Cellulose Acetate | 125 kDa | > 650 |
值得一提的是：由于PCR技術(shù)的發(fā)展，即便痕量DNA污染都會(huì)導(dǎo)致假陽性的結(jié)果,，因此在進(jìn)行核酸操作時(shí)推薦大家使用PCR-grade級(jí)別的超濾管,。
如果需要濃縮病毒，可以參考下表選擇超濾產(chǎn)品：
Target Protein MW | Target Biomolecule Size | Recommended membrane MWCO | Estimated membrane pore size |
900-1,800kD | 90-200nm | 300kD | 30nm |
300-900kD | 30-90nm | 100kD | 10nm |
150-300kD | 15-30nm | 50kD | 7nm |
90-180kD |
| 30kD | 4nm |
30-90kD |
| 10kD | 2.5nm |
15-30kD |
| 5kD | 1.5nm |
10-20kD |
| 3kD | 1.2nm |
3-10kD |
| 2kD | 1nm |
100K,、300K的Vivaspin/Vivaflow超濾產(chǎn)品在CAR-T和進(jìn)行病毒包裝的客戶中有大量應(yīng)用呢,！
漏蛋白,？可能你的樣品選錯(cuò)了膜材質(zhì)
每種膜都有化學(xué)兼容性，在使用之前要確認(rèn)樣品成分尤其是樣品中的去垢劑是否和膜材質(zhì)兼容,，這樣才不會(huì)造成樣品的泄漏和污染,。再比如有的客戶樣品中含有咪唑，含量為200mM,，如果他使用Vivaspin或Vivaspin Turbo可以直接使用,，因?yàn)閂ivaspin或Vivaspin Turbo可以耐受500mM,而他如果選擇某些只耐受100mM的超濾管就必須進(jìn)行稀釋，否則就有可能發(fā)生泄漏,。因此,，使用前仔細(xì)察看超濾產(chǎn)品的化學(xué)兼容性非常重要。
還有就是：
請(qǐng)養(yǎng)成一個(gè)好習(xí)慣: 超濾結(jié)束,，等待終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果出來之后再棄去濾出液,！
因?yàn)槿绻l(fā)生問題，可以對(duì)我們可能出現(xiàn)的問題進(jìn)行分析,。
巧用預(yù)處理,，達(dá)到低濃度樣品的大回收
如果樣品濃度很低，無法做后續(xù)分析,，這樣就需要通過超濾來濃縮樣品,。Vivaspin采用超低吸附的PES材質(zhì)濾膜，蛋白回收率高達(dá)95%,，另外我們還有吸附極低的Hydrosart膜可以選擇,。對(duì)于有些樣品含量非常少的情況，除了選擇我們吸附量很低的膜,，我們還有如下法寶推薦,！
a.盡量選擇較小的截留分子量的膜
b.選擇帶有尖角收集器的膜，以便大限度回收樣品
c.使用水平轉(zhuǎn)子優(yōu)于角轉(zhuǎn)子
d.濃縮完用緩沖液清洗多次回收, 注意移液器的槍頭不要碰到膜,，以免膜破裂,。
e.使用前可以先對(duì)膜進(jìn)行“封閉鈍化”。
鈍化步驟：先用Arium水清洗,，用移液器去除殘留水分,。選擇下面推薦的一種鈍化液室溫至少2小時(shí)或過夜浸泡（除了Triton X-100不推薦過夜），去除鈍化液,，用Arium水沖洗3-4遍,。直接使用或4度Arium水保存。
Type Concentration
Powdered milk 1% in Arium water
BSA 1% in PBS
Tween 20 5% in Arium water
SDS 5% in Arium water
Triton X-100 5% in Arium water
PEG 3000 5% in Arium water
Table 1: 封閉液
Vivaspin超濾管系列具有的尖角死體積樣品安全保護(hù)技術(shù),，防意外甩干,，給珍貴的樣品更多一道保障！另外，根據(jù)蛋白的分子量和體積的不同,，Vivaspin系列有多達(dá)24種不同選擇,。樣品處理體積包括從100μl到20ml，截留分子量也涵蓋了2KDa到0.2um,。