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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產業(yè) |
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該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任何載體的任何位點,，兼容未純化PCR產物、
產品介紹
Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒,，精心優(yōu)化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix預混了重組酶和重組反應所需緩沖液,，并添加了的重組增強因子,，用于同源重組可顯著提高重組克隆效率。
該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任何載體的任何位點,，兼容未純化PCR產物,、直接回收的PCR產物、低濃度的膠回收產物,，本產品可重組同源臂GC含量30%-70%的接頭片段,。將載體線性化，并在插入片段正,、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列,，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的一致的序列。PCR產物和線性化載體在重組酶的作用下,，在50℃條件下最快僅需5 min即可完成重組反應,。克隆陽性率可達95%以上,。
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 10923ES05 | 10923ES20 | 10923ES50 |
10923-A | 2 × Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 50 μL | 200 μL | 500 μL |
10923-B | 500 bp control insert (25 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
10923-C | pUC 19 control vector, linearized (50 ng/μL) | 5 μL | 5 μL | 5 μL |
儲存條件
-25~-15℃保存,，有效期1年。
簡版使用說明
1.重組反應
1)線性化載體和插入片段使用量
Hieff Clone®重組反應體系各個片段及載體插入總濃度為0.02 - 1 pmol,。載體與各個插入片段摩爾比為1:2*。對應的DNA質量可由以下公式計算獲得：
pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對數 × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段約為0.15 pmol
*當插入片段長度大于載體時,，最適載體與插入片段使用量的計算方式應互換,，即插入片段當做載體,，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的反應終濃度可達到1 ng/μL,。線性化載體和插入片段擴增產物未純化直接使用時,，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL,。
簡便的投入量計算公式：插入片段投入量=2×插入片段長度×插入載體投入質量/載體長度
2)重組反應體系（可等比擴大或縮減反應體系,，冰上配制，各組分使用前需混勻）
組分 | 重組反應體系 |
2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix | 10 μL |
每個插入片段投入量 | X |
目的載體投入量 | Y |
ddH2O | To 20 μL |
表1 反應體系
3)重組反應條件
體系配制完成后,，用移液器輕輕吸打混勻各組分,，短暫離心將反應液收集至管底。
當插入1個片段時,，反應條件為50℃,，5 min；當插入片段數為2-6個時,，建議反應條件為50℃,，10 -50 min（反應時間隨片段數增多而延長，如表2所示）,。超長載體片段連接,，建議反應時間為40-60 min。
連接片段數 | 重組反應時間 |
2 | 10 min |
3 | 20 min |
4 | 30 min |
5 | 40 min |
6 | 50 min |
表2 反應時間
反應產物可直接進行轉化,，也可儲存于-20℃,，待需要時解凍轉化。
轉化
提前15分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預熱,。
在冰上解凍快速克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）,。
取10 μL冷卻重組產物,，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數下混勻,，在冰上放置5 min,。
用200 μL移液槍將上一步的混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養(yǎng)基上，均勻涂布,。
將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng),。若進行藍白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h,。
克隆鑒定
快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye),，Cat#10157ES），加入引物直接進行PCR反應,。推薦至少使用一條通用測序引物進行菌落PCR，可以避免PCR假陽性的產生,。后續(xù)也可用于酶切或測序鑒定,。
注意事項
1.需自備的材料：
1)自備樣品：自備好線性化載體和插入片段,。
2)自備試劑（僅羅列部分）：
超級感受態(tài)：轉化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α快速化學感受態(tài)細胞（Cat#11803ES）,。
高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產品。
菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產品,。
核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產品,。
3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽,，切膠儀,，EP管等。
2. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作,。
3. 本產品僅作科研用途！
