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通用型一步法無縫克隆試劑盒(用于同源重組)Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒,，精心優(yōu)化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix預(yù)混了重組酶和重組反應(yīng)所需緩沖液,，并添加了的重組增強因子,，用于同源重組可顯著提高重組克隆效率。

該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點,，兼容未純化PCR產(chǎn)物,、直接回收的PCR產(chǎn)物,、低濃度的膠回收產(chǎn)物,，本產(chǎn)品可重組同源臂GC含量30%-70%的接頭片段。將載體線性化，并在插入片段正,、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列,，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應(yīng)的一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下,，在50℃條件下最快僅需5 min即可完成重組反應(yīng),。克隆陽性率可達95%以上,。

組分信息

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

簡版使用說明

1.重組反應(yīng)

  1)線性化載體和插入片段使用量

Hieff Clone®重組反應(yīng)體系各個片段及載體插入總濃度為0.02 - 1 pmol,。載體與各個插入片段摩爾比為1:2*,。對應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：

pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段約為0.15 pmol

*當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應(yīng)互換,，即插入片段當做載體,，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的反應(yīng)終濃度可達到1 ng/μL,。線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化直接使用時,，使用總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL,。

簡便的投入量計算公式：插入片段投入量=2×插入片段長度×插入載體投入質(zhì)量/載體長度

2)重組反應(yīng)體系（可等比擴大或縮減反應(yīng)體系,，冰上配制，各組分使用前需混勻）

表1 反應(yīng)體系

3)重組反應(yīng)條件

1. 體系配制完成后,，用移液器輕輕吸打混勻各組分,，短暫離心將反應(yīng)液收集至管底。

2. 當插入1個片段時,，反應(yīng)條件為50℃,，5 min；當插入片段數(shù)為2-6個時,，建議反應(yīng)條件為50℃,，10 -50 min（反應(yīng)時間隨片段數(shù)增多而延長，如表2所示）,。超長載體片段連接,，建議反應(yīng)時間為40-60 min。

表2 反應(yīng)時間

3. 反應(yīng)產(chǎn)物可直接進行轉(zhuǎn)化,，也可儲存于-20℃,，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

2. 轉(zhuǎn)化

1. 提前15分鐘將用到的篩選培養(yǎng)基平板拿到37℃預(yù)熱,。

2. 在冰上解凍快速克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell,，Cat#11803ES）,。

3. 取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中,，輕彈管壁數(shù)下混勻,，在冰上放置5 min。

4. 用200 μL移液槍將上一步的混合物轉(zhuǎn)移到已經(jīng)37℃預(yù)熱的LB培養(yǎng)基上,，均勻涂布,。

5. 將平板置于37℃培養(yǎng)箱倒置過夜培養(yǎng)。若進行藍白斑篩選操作,，平板在37℃至少倒置培養(yǎng)15 h,。

3. 克隆鑒定

快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye),，Cat#10157ES）,，加入引物直接進行PCR反應(yīng)。推薦至少使用一條通用測序引物進行菌落PCR,，可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生,。后續(xù)也可用于酶切或測序鑒定。

注意事項

1.需自備的材料：

    1)自備樣品：自備好線性化載體和插入片段,。

    2)自備試劑（僅羅列部分）：

1. 超級感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg,，如翌圣DH5α快速化學感受態(tài)細胞（Cat#11803ES）。

2. 高保真酶：2× Hieff Canace® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產(chǎn)品,。

3. 菌落PCR mix：2× Hieff® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產(chǎn)品,。

4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產(chǎn)品。

    3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀,，水平電泳槽,，切膠儀，EP管等,。

2. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途,！