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16812ESHieff® Fast Cell Direct RT set (for sybr)
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)- 16812ES 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：189更新時間：2025-02-07 13:47:21
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 兩周 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
|---|
產(chǎn)品介紹
Hieff® Fast Cell Direct SYBR Green RT-qPCR Kit 適用于對各種動物細(xì)胞進(jìn)行RNA提?。ㄈ鏲ell line 化的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞,、原代培養(yǎng)細(xì)胞、各種干細(xì)胞,、iPS 細(xì)胞等）,，無需提RNA，可直接進(jìn)行qPCR表達(dá)分析,，用時短，操作簡單,，出錯率低,，最短只需1.5小時就可高效完成從模板制備到反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及基因表達(dá)分析等步驟。該產(chǎn)品為染料法細(xì)胞直擴(kuò)RT-qPCR試劑盒的反轉(zhuǎn)錄模塊,，為補(bǔ)充試劑,。
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 16812ES40 | 16812ES60 |
16812-A | 4× Hifair® FCD RT Mix | 200 μL | 500 μL |
16812-B | RNase Free H2O | 2 mL | 5 mL |
儲存條件
長期保存時請于-25~-15℃保存，有效期6個月,。
使用說明
一,、裂解產(chǎn)物的制備
將試劑放置室溫下融化，使用前上下顛倒,，輕輕混勻,，并輕微離心后使用,，避免起泡。沒有混勻試劑,、使用振蕩器混勻,、未在冰上配置試劑等會導(dǎo)致反應(yīng)性能下降。
將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中*,，5000 rpm離心2 min收集細(xì)胞**,，充分吸除培養(yǎng)基。若貼壁細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng),，可直接吸除培養(yǎng)基,。
各個孔內(nèi)加入FCD Washing Buffer 150 μL，吸打清洗細(xì)胞,，5000 rpm離心2 min,，吸盡FCD Washing Buffer。
各孔中加入48 μL FCD Lysis Buffer溶液,，2 μL DNase I溶液,，室溫吸打混勻后靜置5 min，孵育后加入2.5 μL FCD Stop Solution***, 吸打混勻5次左右,，即可得到裂解產(chǎn)物****,，細(xì)胞數(shù)量超過1× 105 cells時可能會有裂解殘留物屬正常現(xiàn)象,。
*50 μL裂解體系適配細(xì)胞數(shù)的基本要求是每孔1× 104,，該試劑盒可使用范圍是1 × 103 - 1 × 106 cells，若細(xì)胞數(shù)量較多,，可適當(dāng)?shù)缺壤黾覨CD Lysis Buffer溶液和DNase Ⅰ溶液的用量,。
**不同細(xì)胞的離心條件不同，請使用適合于所用細(xì)胞的離心速度進(jìn)行離心,。
***50 μL的裂解液需加入2.5 μL的FCD Stop Solution,。依實(shí)驗(yàn)需要，加入裂解液量增大時需相應(yīng)增大FCD Stop Solution的量,。
****細(xì)胞裂解產(chǎn)物溶液長期保存時,，請置于-25~-15℃。
二,、反轉(zhuǎn)錄
室溫融化4× Hifair® FCD RT Mix后輕微顛倒混勻,，置于冰上并按下表配置反應(yīng)體系：
組分 | 體積 （μL） | 終濃度 |
4× Hifair® FCD RT Mix | 5 | 1× |
裂解產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表1 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系
*避免吸入細(xì)胞碎片，推薦使用量為2-5 μl,，最大不超過反應(yīng)體系的45%,。
移液器輕輕混勻上述配制的反應(yīng)液，按下表程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)**：
反應(yīng)溫度 | 反應(yīng)時間 |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序
**反轉(zhuǎn)錄溫度推薦使用55℃，對于高GC含量模板或者復(fù)雜模板,，可將反轉(zhuǎn)錄溫度提高到 60℃,。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接進(jìn)行下游RT-qPCR檢測。為避免反轉(zhuǎn)錄體系對qPCR反應(yīng)的抑制,，得到合適的Ct值（10-35）,，可將產(chǎn)物稀釋10-1000倍后使用。若短時間內(nèi)不進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn),，可放置于-25~-15℃保存,。
三、熒光定量PCR
體系配置
使用下列組份比例配制反應(yīng)液（配制過程請于冰上進(jìn)行）：
組分 | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Hieff® FCD qPCR SYBR Master Mix | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.4 | 200 nM |
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物* | x | - |
RNase-free H2O | Up to 20 | - |
表3 qPCR反應(yīng)體系
*反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加入量不要超過RT-qPCR體積的1/10,。高濃度模板易導(dǎo)致非特異擴(kuò)增,，適當(dāng)稀釋5-50倍。模板推薦用量4 μL,，盡量不要超過6 μL,。反應(yīng)性能較差時，可以在0.2-1.0 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度,。
熒光定量PCR常規(guī)擴(kuò)增程序（推薦）
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 35-40 |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認(rèn)設(shè)置 | 1 | |
表4 qPCR反應(yīng)程序（常規(guī)）
熒光定量PCR快速擴(kuò)增程序
實(shí)驗(yàn)條件允許時,，也可使用快速程序進(jìn)行擴(kuò)增。
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 95℃ | 10 sec | 1 |
變性 | 95℃ |
| 40 |
退火/延伸** | 60℃ | 10 sec | |
熔解曲線階段 | 儀器默認(rèn)設(shè)置 | 1 | |
表5 qPCR反應(yīng)程序（快速）
**退火/延伸溫度,、終延伸時間可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求適當(dāng)調(diào)整,。 快速程序適用于絕大多數(shù)基因，個別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)基因可嘗試常規(guī)程序,。
注意事項
使用前,，將凍存的各組分充分融解并輕輕混勻后使用。
實(shí)驗(yàn)時,，請盡量使用無污染的耗材,，避免污染。
本產(chǎn)品避免反復(fù)凍融,，配制時應(yīng)避免強(qiáng)光照射,。
為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。
本產(chǎn)品僅作科研用途,！
