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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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12304ES08Illumina平臺極速RNA建庫試劑盒
| 參考價: | 面議 |
具體成交價以合同協(xié)議為準- 12304ES08 產(chǎn)品型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
訪問次數(shù)：592更新時間：2023-03-15 09:53:11
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- www.yeasen.com
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 8 T |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 12304ES08 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè) |
| 主要用途 | 研究 |
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品編號 | 規(guī)格 | 價格/元 |
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina® Illumina平臺極速RNA建庫試劑盒 | 12304ES08 | 8 T | 4875.00 |
12304ES24 | 24 T | 12675.00 | |
12304ES96 | 96 T | 42875.00 |
產(chǎn)品描述
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®測序平臺的RNA測序文庫構建試劑盒,，包含宿主（人）rRNA去除試劑,，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑，常規(guī)ds-cDNA合成試劑,，轉(zhuǎn)座酶和優(yōu)化的緩沖體系,，以及文庫擴增試劑,。本產(chǎn)品利用專業(yè)開發(fā)設計的新一代轉(zhuǎn)座酶可以完成5~10 ng ds-cDNA建庫,，簡化了操作流程，將建庫時間縮短到3 h,。本試劑盒具有優(yōu)秀的文庫轉(zhuǎn)化率,，可應用于多種臨床樣本的建庫。經(jīng)測序驗證,，不同GC含量的樣本,，均可獲得優(yōu)異的測序結(jié)果，文庫覆蓋度高,，均一性好,，偏好性低，使建庫變得更加簡單高效,。提供的所有試劑都經(jīng)過嚴格的質(zhì)量控制和功能驗證,，保證了文庫構建的穩(wěn)定性和重復性。
產(chǎn)品組分
組分編號和名稱 | 12304ES08 | 12304ES24 | 12304ES96 | ||
12304-A |  | Random Primer & rRNA Removal Mix | 16 μL | 48 μL | 192 μL |
12304-B |  | 1st Reaction Buffer | 64 μL | 192 μL | 768 μL |
12304-C |  | 1st Strand Enzyme Mix | 16 μL | 48 μL | 192 μL |
12304-D |
 | 2nd Reaction Buffer | 56 μL | 168 μL | 672 μL |
12304-E |
| 2nd Strand Enzyme Mix | 24 μL | 72 μL | 288 μL |
12304-F |
| 5×Reaction Buffer | 32 μL | 96 μL | 384 μL |
12304-G |  | Transposome Mix V1 | 40 μL | 120 μL | 480 μL |
12304-H |
| PCR Primer Mix | 24 μL | 72 μL | 288 μL |
12304-I |
| 2×Ultima Amplification Mix | 200 μL | 600 μL | 2×1200 μL |
12304-J |
| N5 (N501)* | 8 μL | —— | —— |
12304-K | N7 (N701)* | 4 μL | —— | —— | |
12304-L |
| N7 (N702)* | 4 μL | —— | —— |
運輸與保存方法
干冰運輸,。-20℃保存,。有效期1年。
注意事項
一,、關于操作
1. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍,。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,，短暫離心后置于冰上待用。
3. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應,，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近,。
4. 請使用無RNase污染的耗材，并對實驗區(qū)域定期進行清理,，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染,。
5. PCR產(chǎn)物因操作不當極容易產(chǎn)生氣溶膠污染，進而影響實驗結(jié)果準確性,。推薦將PCR反應體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進行強制性的物理隔離,；配備文庫構建專用移液器等設備；定時對各實驗區(qū)域進行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除噴霧）,，以保證實驗環(huán)境的潔凈度,。
6. 本產(chǎn)品僅作科研用途,！
二、關于產(chǎn)品原理
本產(chǎn)品基于轉(zhuǎn)座酶法開發(fā),，其核心原理是轉(zhuǎn)座酶及其轉(zhuǎn)座機制,。在 Transposome Mix 中包含由轉(zhuǎn)座酶和兩種等摩爾的接頭Adapter 1和Adapter 2構成一個完整的轉(zhuǎn)座子。轉(zhuǎn)座發(fā)生時,，該轉(zhuǎn)座子將 Adapter 1 和 Adapter 2 接頭序列插入靶基因中,，形成一端帶有Adapter 1，一端帶有 Adapter 2 的 DNA,，之后利用DNA聚合酶將轉(zhuǎn)座形成的切口補齊,。這種產(chǎn)物經(jīng) N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix)兩對引物擴增，產(chǎn)物經(jīng)分選和純化后即為可測序文庫,。
圖1 Transposome的工作原理
三,、關于ds-cDNA的片段化
1. 本試劑盒適用5~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前,，使用基于雙鏈 DNA 熒光染料的方法,，如 Qubit® ，PicoGreen®等進行定量,?！咀ⅲ篢ransposome Mix 對 DNA 濃度非常敏感，所以準確的 DNA 濃度測定對實驗成功與否至關重要,?！?/span>
四、DNA磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. 建庫過程中有多個步驟需要使用DNA純化磁珠,，我們推薦使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進行DNA純化和分選,。
2. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降,、分選效果不佳,。
3. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
4. 轉(zhuǎn)移上清時,，請勿吸取磁珠,，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量。
5. 磁珠洗滌使用的80%乙醇應現(xiàn)用現(xiàn)配,，否則將影響回收效率,。
6. 產(chǎn)物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續(xù)反應,；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率,。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥,。
7. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存,，可使用0.1×TE Buffer洗脫,，產(chǎn)物于4°C可保存2天，-20°C可保存1個月,。
五,、關于文庫質(zhì)檢 (Library Quality Analysis)
1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質(zhì)量評價,。
2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法,，如Qubit®、PicoGreen®等,；基于qPCR絕對定量的方法,。
3. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物,、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構產(chǎn)物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理,，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫）,，可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
4. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法,，如NanoDrop®等,。
5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測,。
六,、自備材料 (Other Material)
1. DNA純化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效產(chǎn)品。
2. N5 (N5XX)和N7 (N7XX) Index引物：Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) (Cat#12610ES96),。
3. 文庫質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品,；文庫定量試劑。
4. 其他材料：無水乙醇,、無菌超純水,、低吸附槍頭、PCR管,、磁力架,、PCR儀等。
建庫流程
圖2 極速 RNA建庫操作流程
使用方法
Step 1 宿主rRNA的去除
1. 將 Random Primer & rRNA Removal Mix室溫解凍后,，顛倒混勻,，置于冰上備用。按照下表配置反應液：
表1 宿主rRNA去除反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
Random Primer & rRNA Removal Mix | 2 |
RNA (10 ng~500 ng) | 13 |
Total | 15 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻,，瞬離將反應液離心至管底,。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表2所示設置反應程序,，進行RNA的預變性,。
表2 宿主rRNA去除反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 105°C | On |
85°C | 5 min |
72°C | 2 min |
60°C | 10 min |
立即置于冰上 | 3 min |
Step 2 第一鏈cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)
1. 將第一鏈合成試劑從-20°C取出,，室溫解凍，顛倒混勻后瞬離,。按表6所示,，配制第一鏈cDNA合成的反應液。
表3 第一鏈cDNA合成反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
變性的RNA | 15 |
1st Reaction Buffer | 8 |
1st Strand Enzyme Mix | 2 |
Total | 25 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻,，瞬離將反應液離心至管底,。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表4所示設置反應程序,，進行第一鏈cDNA的合成,。反應結(jié)束后立即進行第二鏈cDNA的合成。
表4第一鏈cDNA合成反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 105°C | On |
25°C | 5 min |
42°C | 30 min |
85°C | 5 min |
4°C | Hold |
Step 3第二鏈cDNA的合成 (2nd Strand Synthesis)：
1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出,，解凍后顛倒混勻,；按照表5所示，配制第二鏈cDNA合成反應液,。
表5 第二鏈cDNA合成反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
1st Strand cDNA | 25 |
2nd Reaction Buffer | 7 |
2nd Strand Enzyme Mix | 3 |
Total | 35 |
2. 使用移液器輕輕吹打混勻,，瞬離將反應液離心至管底。
3. 將上述PCR管置于PCR儀中,，按照表6所示設置反應程序,，進行第二鏈cDNA的合成。
表6 第二鏈cDNA合成反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋 | Off |
16°C | 30 min |
4°C | Hold |
Step4 cDNA產(chǎn)物純化 (Post Ligation Clean Up)
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻,。
3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×,，Beads:DNA=0.6:1)至第二鏈cDNA產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻,，室溫孵育5 min,。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后,，小心移除上清。
6. 重復步驟5,，總計漂洗兩次,。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）。
8. 將PCR管從磁力架中取出,，加入14 μL ddH2O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約3 min），小心移取12 μL上清至新PCR管中,，取1 μL的純化測第二鏈cDNA產(chǎn)物進行Qubit 定量,，進行轉(zhuǎn)座酶的片段化。
Step 5 DNA段化 (DNA Tagment)
1. 準備工作：將 Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇。將5×Reaction Buffer 室溫解凍后,，顛倒混勻,，置于冰上備用。
2. 于無菌 PCR 管中配制表 7 所示反應體系,。
表7 片段化反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
2nd Strand cDNA純化產(chǎn)物 | 5~10 ng |
5×Reaction Buffer | 4 |
Transposome Mix V1 | 5 |
ddH2O | Up to 20 |
3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻,，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將上述PCR管置于PCR儀,，設置表8所示反應程序，進行DNA段化,，末端修復及dA尾添加反應,。
表8 片段化的反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105°C | on |
55°C | 10 min |
4°C | Hold |
Step 6 文庫擴增 (Library Amplification)
該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進行PCR擴增富集。
1. 將表8中的試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用,。
2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應體系。
表9 文庫擴增PCR反應體系
組分名稱 | 體積 (μL) |
片段化產(chǎn)物 | 20 |
PCR Primer Mix | 3 |
N5XX* | 1 |
N7XX* | 1 |
2×Ultima Amplification Mix | 25 |
Total | 50 |
【注】：*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8種N5XX和12種N7XX,，可根據(jù)樣品數(shù)量和Index選擇策略自行選擇,。
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底,。
4. 將PCR管置于PCR儀中,，設置表10示反應程序，進行PCR擴增,。
表10 文庫擴增PCR擴增反應程序
溫度 | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
72°C | 3 min | 1* |
95°C | 1 min | 1 |
95°C | 10 sec | 13~15 cycles** |
55°C | 30 sec | |
72°C | 30 sec | |
72°C | 1 min | 1 |
4°C | Hold | - |
【注】：*此步不可省略,。轉(zhuǎn)座反應產(chǎn)物并非完整的雙鏈 DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板,。
**循環(huán)數(shù)請根據(jù)測序需要進行選擇,。起始 DNA 量為 5-10 ng 時，推薦 13-15 個擴增循環(huán)。
Step 7 擴增產(chǎn)物磁珠純化 (Post Amplification Clean Up)
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻,。
3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×,，Beads:DNA=0.9:1)至PCR產(chǎn)物中，渦旋或吹打混勻,，室溫孵育5 min,。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后,，小心移除上清。
6. 重復步驟5,，總計漂洗兩次,。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）,。
8. 將PCR管從磁力架中取出,，加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約3 min）,，小心移取20 μL上清至新PCR管中,，進行文庫定量、質(zhì)檢,。
Step 8 文庫質(zhì)量控制
通常情況下,，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質(zhì)量評價，具體請參見注意事項五,。
使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®對50 ng ~500 ng 293 RNA樣本建庫,，使用0.9×磁珠進行PCR后純化，結(jié)果使用Agilent 2100 Bioanalyzer進行檢測,。
圖3 極速 RNA建庫峰圖
HB220117
