產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® OnePot^TM II DNA Library Prep Kit for MGI^®是針對MGI^®高通量測序平臺專業(yè)開發(fā)設(shè)計(jì)的新一代酶切法建庫試劑盒。與傳統(tǒng)的建庫法比較,，本品采用高質(zhì)量的片段化酶,，擺脫了繁瑣的超聲過程，同時(shí)簡化了操作流程,，將片段化模塊與末端修復(fù)模塊合二為一,，極大的降低了建庫的時(shí)間和成本。本試劑盒具有優(yōu)xiu的文庫轉(zhuǎn)化率,，可應(yīng)用于常規(guī)動(dòng)植物基因組,、微生物基因組等樣本，同時(shí)能兼容FFPE DNA樣本的建庫,。經(jīng)測序驗(yàn)證,，不同GC含量的樣本，均可獲得優(yōu)異的測序結(jié)果,，文庫覆蓋度高,，均一性好，偏好性低,，使建庫變得更加簡單高效,。

? 適用10 ng-1 μg的基因組DNA、全長cDNA等樣本

? 高質(zhì)量片段化酶,，可隨機(jī)切割雙鏈DNA,，酶切片段無偏好性

? 片段化、末端修復(fù)/加A一步完成

? 強(qiáng)擴(kuò)增效率的高保真酶,，顯著提高文庫質(zhì)量及產(chǎn)量

? 適用于FFPE DNA樣本

? 嚴(yán)格的批次性能與穩(wěn)定性質(zhì)控

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸,。所有組分-20°C保存,，有效期1年。

注意事項(xiàng)

一,、關(guān)于操作

1. 為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍,。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻,，短暫離心后置于冰上待用。

3. 配制各步驟反應(yīng)液時(shí)推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩,，劇烈振蕩可能會(huì)造成文庫產(chǎn)出下降,。

4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭,，吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭,。

5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng)，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近,。

6. PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離,；使用的移液器等設(shè)備,；并定時(shí)對各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進(jìn)行擦拭清理），以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度,。

二、關(guān)于DNA///片段化

1. 本試劑盒兼容范圍為10 ng – 1 μg Input DNA,。應(yīng)盡可能使用A₂₆₀/A₂₈₀= 1.8-2.0的高質(zhì)量Input DNA,。

2. 若Input DNA中引入高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn),，建議將DNA稀釋在ddH₂O或不含EDTA的10 mM Tris Buffer (pH 7.5-8.0)中進(jìn)行片段化,。

3. 對于常規(guī)的高質(zhì)量基因組DNA，酶切時(shí)間參考表5,，本試劑盒片段化偏好低,，耐受各種GC含量的模板。對于不同降解程度的FFPE樣本,，酶切時(shí)間參考表6,。以上為推薦時(shí)間，需客戶在自己的實(shí)驗(yàn)體系中進(jìn)行微調(diào),，以達(dá)到蕞佳效果,。

4.為保證優(yōu)質(zhì)精確的片段化效果，片段化反應(yīng)配制過程請于冰上操作,。

5. 針對FFPE DNA建庫,，若樣本質(zhì)量不佳,，客戶對當(dāng)前建庫產(chǎn)量不滿意,，可選購我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)對FFPE DNA進(jìn)行修復(fù),，具體使用方法可參考此產(chǎn)品說明書。該試劑可與片段化末修加A過程同時(shí)進(jìn)行,，無需額外的操作,。

三,、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1. 目前華大智造有2種序號的接頭：1-128和501-596。關(guān)于其使用要求,，請?jiān)斠娙A大智造“關(guān)于Adapter使用"有關(guān)說明或咨詢本公司,。此外，華大智造申明：2種接頭由于設(shè)計(jì)工藝不同,，禁止混用,，否則測序數(shù)據(jù)無法拆分！

2. Adapter的質(zhì)量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產(chǎn)量,。請按照表1和實(shí)際DNA投入量確實(shí)確定接頭用量,，需要稀釋接頭時(shí)，請用TE buffer對接頭進(jìn)行稀釋,。

表1 10ng-1 μg Input DNA推薦的Adapter使用濃度

四,、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1. DNA///片段長度分選步驟可選擇在末端修復(fù)/dA尾添加之前，或接頭連接后,，或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行,。

2. 當(dāng)Input DNA質(zhì)量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選,；如Input DNA質(zhì)量<50 ng,，建議您在文庫擴(kuò)增后進(jìn)行分選。

3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG,，會(huì)對雙輪分選產(chǎn)生顯著影響,。因此，如在接頭連接后進(jìn)行長度分選,，必須先進(jìn)行純化步驟,，再進(jìn)行雙輪分選步驟；如在末端修復(fù)/dA尾添加之前或文庫擴(kuò)增后進(jìn)行長度分選,，可直接進(jìn)行雙輪磁珠分選步驟,。

4. 磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降,、分選效果不佳,。

5. 磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。

6. 轉(zhuǎn)移上清時(shí)，請勿吸取磁珠,，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫質(zhì)量,。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率,。

8. 進(jìn)行長度分選時(shí),，初始樣品體積應(yīng)盡量≥100 μL，不足時(shí)請用超純水補(bǔ)齊,。以防因樣品體積太小導(dǎo)致移液誤差增大,。

9. 產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng),；過分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開裂進(jìn)而降低純化得率,。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥,。

10. DNA純化或長度分選產(chǎn)物如需保存,，可使用TE Buffer洗脫，產(chǎn)物可于4°C可保存1-2周,，-20°C可保存1個(gè)月,。

五、關(guān)于文庫擴(kuò)增（Library Amplification）

文庫擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù),。循環(huán)數(shù)不足,，將導(dǎo)致文庫產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過多,，又將導(dǎo)致文庫偏好性增加,、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加,、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果,。表2列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環(huán)數(shù),。

表2  10 ng-1 μg Input DNA獲得1 μg產(chǎn)物擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表

【注】：建庫過程中若進(jìn)行片段分選，擴(kuò)增時(shí)請參照較高循環(huán)數(shù)擴(kuò)增,。

六,、關(guān)于文庫質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1. 通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),。

2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法,，如Qubit^®、PicoGreen^®等,；基于qPCR定量的方法,。

3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫濃度檢測：Qubit^®,、PicoGreen^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法,，無法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物以及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物,；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理,，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫干擾,。

5. 文庫長度分布檢測,，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測。

使用方法

一,、自備材料

1. 純化磁珠：Cat#12601,，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產(chǎn)品,。

2. DNA質(zhì)控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品,。

3. DNA Adapter：華大智造或本公司

4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水,、TE Buffer（10 mM Tris-HCl,，pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA）、低吸附EP管,、PCR管,、磁力架、PCR儀等,。

二,、操作流程

圖1 OnePot^TM II DNA建庫試劑盒操作流程

三、操作步驟

3.1DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加（DNAFragment/End Preparation/dA-Tailing）

該步驟將基因組DNA///片段化,，同時(shí)進(jìn)行末端修復(fù)及dA尾添加,。

1. 將表3中各試劑解凍后，顛倒混勻,，置于冰上備用,。

2. 于冰上配制表3反應(yīng)體系。

表3  DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加 PCR反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或低速振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液離心至管底,。

4. 將上述PCR管置于PCR儀，設(shè)置表4所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行DNA///片段化,，末端修復(fù)及dA尾添加反應(yīng)。

表4  DNA///片段化/末端修復(fù)/dA尾添加PCR反應(yīng)程序

【注】：*DNA///片段化過程為有效控制片段化效果,，避免過度酶切,，反應(yīng)程序可預(yù)先設(shè)置4°C，待模塊溫度降至4°C時(shí)，將PCR管放入PCR儀即可,。**對于完整的基因組DNA,，酶切時(shí)間參考表5；對于質(zhì)量不一的FFPE DNA樣本,，酶切時(shí)間參考表6,。

圖2  Agilent 2200定義不同降解程度樣本的DIN值

3.2 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟將3.1步驟的產(chǎn)物末端，連接特定的MGI^®接頭,。

1. 根據(jù)Input DNA量按表1稀釋Adapter至合適濃度,。

2. 將表7中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用,。

3. 于3.1步驟PCR管中配制表7所示反應(yīng)體系,。

表7  Adapter Ligation PCR體系

【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒,、振蕩,，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻,，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底,。

5. 將PCR管置于PCR儀中，設(shè)置表8所示反應(yīng)程序,，進(jìn)行接頭連接反應(yīng),。

表8  Adapter Ligation PCR反應(yīng)程序

【注】：當(dāng)Input DNA量較低，實(shí)驗(yàn)效果不理想時(shí),，可嘗試將連接時(shí)間延長一倍,。

3.3 連接產(chǎn)物磁珠純化（Post Ligation Clean Up）

該步驟使用磁珠對3.2步驟的產(chǎn)物進(jìn)行純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產(chǎn)物,。

3.3.1 純化操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇,。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻,。

3. 吸取80μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.8×，Beads:DNA=0.8:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，室溫孵育5 min,。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5,，總計(jì)漂洗兩次,。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過5 min）,。

8. 將PCR管從磁力架中取出,，進(jìn)行洗脫：

1）如產(chǎn)物無需進(jìn)行片段分選，直接加入21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存,，可使用TE Buffer洗脫】。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠

2）如產(chǎn)物需進(jìn)行雙輪分選,，加入102 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min,?！咀ⅲ喝缂兓a(chǎn)物如需保存，可使用TE Buffer洗脫】,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中,，切勿觸碰磁珠,。

3.3.2 雙輪分選操作步驟：

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min,。配制80%乙醇,。

2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。

3. 根據(jù)DNA///片段長度要求,，參考表9向上述100 μL DNA上清中加入弟一輪分選磁珠,，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻。

表9  磁珠文庫分選推薦比例

【注】：表中“×"表示樣品DNA體積,。如文庫插入片段長度為200 bp,，樣品DNA體積為100 μL，則第—輪分選磁珠使用體積為0.78×100 μL=78 μL,；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL,；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA（Post Ligation）,，如果用戶在接頭連接前進(jìn)行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads（Cat#12601）說明書中推薦的比例,。

4. 室溫孵育5 min,。

5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min）,，小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中,。

6. 參考表7向上清中加入第二輪分選磁珠。

7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,，室溫靜置5 min,。

8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。

9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec,，小心移除上清。

10. 重復(fù)步驟9,。

11. 保持PCR管始終處于磁力架中,，開蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

12. 將PCR管從磁力架中取出,，加入適量21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min,。

13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈的管中,。

3.4 文庫擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集,。

1. 將表10中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用,。

2.于無菌PCR管中配制表10所示反應(yīng)體系,。

表10  PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底,。

4. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表11所示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

表11  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

3.5 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.3.1步驟中純化操作步驟,。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫擴(kuò)增產(chǎn)物,。

如需分選,，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟,。

3.6文庫質(zhì)量控制

通常情況下，構(gòu)建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進(jìn)行質(zhì)量評價(jià),，具體請參見注意事項(xiàng)六。

3.7 文庫環(huán)化

使用Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Cyclization Kit for MGI^®（Cat#13341）或其他等效產(chǎn)品進(jìn)行文庫單鏈環(huán)化反應(yīng),。

3.8 參考實(shí)例

使用Hieff NGS^® OnePot^TM II DNA Library Prep Kit for MGI^®對小牛胸腺gDNA樣本進(jìn)行酶切建庫檢測,，片段化結(jié)果見圖3；建庫結(jié)果見圖4,。

圖3  OnePot^TM II DNA建庫試劑盒酶切800 ng小牛胸腺gDNA樣本（不同酶切時(shí)間片段化效果檢測）

圖4  使用本試劑盒進(jìn)行human gDNA樣本建庫,，文庫進(jìn)行電泳檢測

（Input DNA為50 ng，酶切12 min,，擴(kuò)增8 cycles）

相關(guān)產(chǎn)品

HB191112