Hieff NGS® MaxUp II Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®

MaxUp II 雙模式mRNA 建庫(kù)試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff NGS^® MaxUp^TM II Dual-model mRNA Library Prep Kit for Illumina^®是針對(duì)Illumina^®高通量測(cè)序平臺(tái)專(zhuān)門(mén)研發(fā)的用于mRNA轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，本試劑盒將cDNA二鏈合成與Endprep,、dA-tailing進(jìn)行合并,，極大地縮減建庫(kù)時(shí)間。二鏈合成模塊配有兩種buffer,，客戶(hù)可根據(jù)需要進(jìn)行常規(guī)建庫(kù)或鏈特異性建庫(kù),。本產(chǎn)品適用于起始模板為0.1-4 μg不同來(lái)源真核生物總RNA樣本。經(jīng)過(guò)mRNA分離,、片段化,、雙鏈cDNA合成、末端修復(fù),、加A尾,、接頭連接和文庫(kù)擴(kuò)增，總RNA樣品蕞終轉(zhuǎn)化為適用于Illumina^®平臺(tái)測(cè)序的文庫(kù),。

試劑盒包含兩個(gè)獨(dú)立模塊,，BOX-I的核心為純化mRNA所需的oligo(dT)磁珠。BOX-II包含mRNA//片段化試劑,，反轉(zhuǎn)錄試劑,，常規(guī)和鏈特異性dscDNA合成，以及后續(xù)建庫(kù)所需的所有試劑,。其中鏈特異性二鏈合成buffer中將dTTP替換為dUTP,，使cDNA第二鏈中摻入dUTP,，而本試劑盒使用的高保真DNA聚合酶無(wú)法擴(kuò)增含尿嘧啶的DNA模板,，實(shí)現(xiàn)鏈特異性。提供的所有試劑都經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量控制和功能驗(yàn)證,，蕞大程度上保證了文庫(kù)構(gòu)建的穩(wěn)定性和重復(fù)性,。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋運(yùn)輸。效期一年,。存儲(chǔ)溫度如下,，切不可搞錯(cuò)！

Box I：2-8℃保存,；Box II：-20℃保存,。

注意事項(xiàng)

一、關(guān)于操作

1.為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

2.請(qǐng)于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數(shù)次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用,。

3.推薦在帶熱蓋的PCR儀中進(jìn)行各步驟反應(yīng),，使用前應(yīng)預(yù)熱PCR儀至反應(yīng)溫度附近。

4.請(qǐng)使用無(wú)RNase污染的耗材,，并對(duì)實(shí)驗(yàn)區(qū)域定期進(jìn)行清理,，推薦使用ThermoFisher公司的RNAZap^TM高效核酸去除噴霧去除RNA酶污染。

5.PCR產(chǎn)物因操作不當(dāng)極容易產(chǎn)生氣溶膠污染,，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性,。推薦將PCR反應(yīng)體系配制區(qū)和PCR產(chǎn)物純化檢測(cè)區(qū)進(jìn)行強(qiáng)制性的物理隔離；配備文庫(kù)構(gòu)建移液器等設(shè)備,；定時(shí)對(duì)各實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行清潔（推薦使用ThermoFisher公司的DNAZap^TM高效核酸去除噴霧）,，以保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的潔凈度。

二,、應(yīng)用范圍

本試劑盒適用于起始模板量為0.1-4 μg（體積≤50 μL）的高質(zhì)量動(dòng)物,、植物和真菌等真核生物的總RNA。如初始RNA濃度偏低,，體積超過(guò)50 μL,，可使用Hieff NGS^® RNA Cleaner磁珠進(jìn)行濃縮。RNA需通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片檢測(cè),，RIN值要求＞7,，以保證mRNA有完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)。

本試劑盒的mRNA分離模塊使用的是oligo (dT)磁珠,，只有帶poly(A)尾的mRNA才能被提?。黄渌痪遬oly(A)尾的RNA,，如非編碼RNA,、無(wú)poly(A)尾的mRNA等不能適用本試劑盒。此外,，F(xiàn)FPE樣本中的mRNA降解嚴(yán)重,，通常無(wú)完整的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，故亦無(wú)法使用本試劑盒進(jìn)行建庫(kù),。

本試劑盒所制備文庫(kù)可進(jìn)行多種RNA-Seq應(yīng)用,，包括：

基因表達(dá)（gene expression）

單核苷酸變異檢測(cè)（single nucleotide variation discovery）

基因融合鑒定（gene fusion identification）

剪切變異體分析（splice variant analysis）

三、關(guān)于接頭連接（Adapter Ligation）

1.本公司可提供長(zhǎng)接頭（barcoded Adapter）試劑盒和短接頭（也稱(chēng)為小Y接頭,、不完整接頭）試劑盒,，客戶(hù)可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇。

目前有48種Indexed Adapters: Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 4（Cat#12615~Cat#12618）,；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12611~Cat#12612）,；雙端 384 種 Index Primers: Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1~Set 2 （Cat#12613~Cat#12614）,。

2.我們建議選用高質(zhì)量的商業(yè)化接頭，如客戶(hù)使用自制接頭,，請(qǐng)委托具有NGS引物合成經(jīng)驗(yàn)的公司,，并備注需進(jìn)行嚴(yán)格的防污染控制。此外,，進(jìn)行接頭退火操作時(shí),，請(qǐng)?jiān)诔瑑襞_(tái)完成。每次只操作一種接頭,，防止交叉污染,。

3.使用接頭時(shí)，請(qǐng)?zhí)崆皩⒔宇^取出放在4°C或冰盒上解凍,；在室溫操作時(shí),，實(shí)驗(yàn)室溫度*不要超過(guò)25°C,，防止接頭解鏈,。

4.建庫(kù)過(guò)程中，接頭濃度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)導(dǎo)致建庫(kù)成功率變低,。本試劑盒操作方案中,，所加入的接頭體積固定為5 μL,，請(qǐng)根據(jù)初始的RNA投入量，參考表1對(duì)接頭進(jìn)行稀釋,。接頭稀釋液請(qǐng)選擇0.1×TE buffer,，稀釋過(guò)的接頭可在4°C保存48小時(shí)。

表1 Input Total RNA量與接頭濃度推薦表

四,、關(guān)于磁珠純化與分選（Bead-based Clean Up and Size Selection）

1.建庫(kù)過(guò)程中有多個(gè)步驟需要使用DNA純化磁珠,，我們推薦使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure^® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)進(jìn)行DNA純化和分選。

2.磁珠使用前應(yīng)先平衡至室溫,，否則會(huì)導(dǎo)致得率下降,、分選效果不佳。

3.磁珠每次使用前都應(yīng)充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻,。

4.轉(zhuǎn)移上清時(shí),，請(qǐng)勿吸取磁珠,，即使微量殘留都將影響后續(xù)文庫(kù)質(zhì)量,。

5.磁珠洗滌使用的80%乙醇應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，否則將影響回收效率,。

6.產(chǎn)物洗脫前應(yīng)將磁珠置于室溫干燥,。干燥不充分容易造成無(wú)水乙醇?xì)埩粲绊懞罄m(xù)反應(yīng)；過(guò)分干燥又會(huì)導(dǎo)致磁珠開(kāi)裂進(jìn)而降低純化得率,。通常情況下,，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥,。

7.DNA純化或長(zhǎng)度分選產(chǎn)物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脫,，產(chǎn)物于4°C可保存2天,，-20°C可保存1個(gè)月。

五,、關(guān)于文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

1.本試劑盒中的文庫(kù)擴(kuò)增組分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所組成,，在*代的基礎(chǔ)上，大大增強(qiáng)了擴(kuò)增的均一性,，即使是低拷貝的基因,，也能進(jìn)行無(wú)偏好性地?cái)U(kuò)增。

2.如果您使用Indexed Adapter（也稱(chēng)為長(zhǎng)接頭,、大Y接頭）,，可使用本試劑盒提供的引物Primer mix進(jìn)行擴(kuò)增；如果使用的是“短接頭”或者叫“小Y接頭”,，則需要使用index primers進(jìn)行擴(kuò)增,，加上相應(yīng)的barcodes。

3.文庫(kù)擴(kuò)增步驟需要嚴(yán)格控制擴(kuò)增循環(huán)數(shù),。循環(huán)數(shù)不足,，將導(dǎo)致文庫(kù)產(chǎn)量低；循環(huán)數(shù)過(guò)多,，又將導(dǎo)致文庫(kù)偏好性增加,、重復(fù)度增加、嵌合產(chǎn)物增加,、擴(kuò)增突變積累等多種不良后果,。表2列舉了使用本試劑盒進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增，Input Total RNA量與相應(yīng)擴(kuò)增循環(huán)數(shù)的推薦,。

表2 Input Total RNA量與擴(kuò)增循環(huán)數(shù)推薦表*

【注】：*由于不同物種和組織所提取的Total RNA中,，mRNA的含量差異較大。實(shí)驗(yàn)中需根據(jù)建庫(kù)起始量,、物種類(lèi)型及樣本處理情況適當(dāng)調(diào)整擴(kuò)增循環(huán)數(shù),。

六、關(guān)于文庫(kù)質(zhì)檢（Library Quality Analysis）

1.通常情況下,，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)長(zhǎng)度分布檢測(cè)和濃度檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),。

2.文庫(kù)濃度檢測(cè)可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit^®,、PicoGreen^®等,；基于qPCR定量的方法。

3.推薦使用qPCR方法進(jìn)行文庫(kù)濃度檢測(cè)：Qubit^®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測(cè)定方法時(shí),，無(wú)法有效區(qū)分單端連接Adapter的產(chǎn)物,、兩端均未連接Adapter的產(chǎn)物及其他不完整雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)物,；qPCR定量基于PCR擴(kuò)增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫(kù)（即可測(cè)序的文庫(kù)）,，可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測(cè)序文庫(kù)的干擾,。

4.文庫(kù)濃度檢測(cè)不可使用：基于光譜檢測(cè)的方法，如NanoDrop^®等,。

5.文庫(kù)長(zhǎng)度分布檢測(cè),，可通過(guò)Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細(xì)管電泳或微控流原理的設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。

使用方法

一,、自備材料

1.純化磁珠：Hieff NGS^® DNA Selection Beads（Cat#12601）或AMPure XP Beads（Cat#A63880）或其他等效產(chǎn)品,。

2.RNA質(zhì)控：Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效產(chǎn)品。

3.Adapters：barcoded adapter（長(zhǎng)接頭）或者無(wú)barcode的短接頭試劑盒,。

4.文庫(kù)質(zhì)檢：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效產(chǎn)品,；文庫(kù)定量試劑。

5.其他材料：無(wú)水乙醇,、無(wú)菌超純水,、低吸附槍頭、PCR管,、磁力架,、PCR儀等。

二,、操作流程

                圖1 mRNA建庫(kù)試劑盒操作流程

三,、操作步驟

3.1 mRNA純化和片段化（mRNA Purification and Fragmentation）

1.將mRNA Capture Beads從2-8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫,，約30 min,。

2.準(zhǔn)備一個(gè)Nuclease free離心管，取0.1-4 μg總RNA,，用Nuclease free水將體積補(bǔ)至50 μL,，冰上放置備用。

3.顛倒或旋渦振蕩混勻磁珠,，吸取50 μL磁珠懸液加入至50 μL總RNA樣品中,，用移液器吹打6次，使其充分混勻,。

4.將磁珠與RNA的混合物置于PCR儀中,，65℃，5 min,；4℃,，hold,，使得RNA變性,。

5.室溫孵育5 min,，使mRNA與磁珠*結(jié)合。

6.將樣品置于磁力架中,，室溫靜置5 min,，使mRNA與總RNA分離，小心移除上清,。

7.將樣品從磁力架上取出,，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠，移液器反復(fù)吹打6次以*混勻,。將樣品置于磁力架中,，室溫靜置5 min，小心移除上清,。

8.重復(fù)步驟7,，共洗滌兩次。

9.將樣品從磁力架上取出,，加入50 μL Tris Buffer重懸磁珠,，用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

10.將樣品置于PCR儀中,，80℃,，2 min；25℃,，hold,，將mRNA洗脫下來(lái)。

11.將樣品從PCR儀中取出,，加入50 μL Beads Binding Buffer,，用移液器反復(fù)吹打6次以*混勻。

12.室溫放置5 min,，使mRNA結(jié)合到磁珠上,。

13.將樣品置于磁力架中，室溫靜置5 min,，小心移除上清,。

14.將樣品從磁力架上取出，用200 μL Beads Wash Buffer重懸磁珠,，移液器反復(fù)吹打6次以*混勻,，將樣品重新放回至磁力架中，室溫靜置5 min,，吸掉全部上清,。

【注】：蕞后需要用10 μL移液器吸干凈殘留液體。

15.將樣品從磁力架上取出,，用18.5 μL Frag/Prime buffer重懸磁珠,，用移液器吹打6次以*混勻,；將樣品置于PCR儀中（預(yù)設(shè)為94℃或85℃），可參考表3選擇片段化程序,，但不同物種片段化的效果有差異,，客戶(hù)可先根據(jù)自己的情況，做個(gè)片段化時(shí)間的梯度,，比如94℃,，5 min或85℃，6 min,。使用Agilent 2100分析雙鏈cDNA純化產(chǎn)物大小,。

表3 mRNA//片段化程序選擇

16. 片段化程序結(jié)束后，為防止poly(A)尾RNA與磁珠結(jié)合,，請(qǐng)立即將樣品置于磁力架中,，待溶液澄清后，轉(zhuǎn)移17 μL上清至一個(gè)新的nuclease free離心管中,，立刻進(jìn)入*鏈合成反應(yīng),。

3.2 *鏈cDNA的合成：

1. 將*鏈合成試劑從-20°C取出，顛倒混勻后瞬離,。按表4所示,，配制*鏈cDNA合成的反應(yīng)液。

表4 *鏈cDNA合成反應(yīng)體系

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,，瞬離將反應(yīng)液離心至管底,。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中，按照表5所示設(shè)置反應(yīng)程序,，進(jìn)行*鏈cDNA的合成,。反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。

表5 *鏈cDNA合成反應(yīng)程序

3.3第二鏈cDNA的合成/末端修復(fù)/加A：

1. 將第二鏈合成試劑從-20 °C取出,，解凍后顛倒混勻,；按照表6所示，配制第二鏈cDNA合成/末端修復(fù)/加A反應(yīng)液。

表6 第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系

【注】：*如構(gòu)建普通mRNA文庫(kù),，請(qǐng)使用含dNTP的buffer,；如構(gòu)建鏈特異性mRNA文庫(kù)，請(qǐng)使用含dUTP的buffer,。

2. 使用移液器輕輕吹打混勻,，瞬離將反應(yīng)液離心至管底,。

3. 將上述PCR管置于PCR儀中,，按照表7所示設(shè)置反應(yīng)程序，進(jìn)行第二鏈cDNA的合成,。

表7 第二鏈cDNA合成反應(yīng)程序

3.4 接頭連接（Adapter Ligation）

該步驟可在末端修復(fù)和dA尾添加的產(chǎn)物末端,，連接特定的Illumina^®接頭。

1. 參考注意事項(xiàng)三中的表1,，根據(jù)Input RNA量,，稀釋Adapter至合適濃度。

2. 將表8中各試劑解凍后顛倒混勻,，置于冰上備用,。

3. 于3.3步驟結(jié)束后的PCR管中繼續(xù)配制表8所示反應(yīng)體系。

表8 Adapter Ligation體系

【注】：*Ligation Enhancer使用前請(qǐng)上下顛倒,、振蕩,，充分混勻并瞬時(shí)離心后使用。

**本公司接頭原始濃度為15 μM, 請(qǐng)根據(jù)注意事項(xiàng)三表1的提示,，用0.1×TE buffer對(duì)接頭進(jìn)行稀釋?zhuān)?/span>使接頭添加體積固定為5 μL,。

4. 使用移液器輕輕吹打混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底,。

5. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表9所示反應(yīng)程序，進(jìn)行接頭連接反應(yīng)：

表9 Adapter Ligation反應(yīng)程序

【注】：當(dāng)Input DNA量較低時(shí),，可嘗試將連接時(shí)間延長(zhǎng)一倍,，這將提高連接效率。

3.5 連接產(chǎn)物純化和片段大小分選（Post Ligation Clean Up and Size Selection）

目前有兩個(gè)方案應(yīng)用于該步驟,，當(dāng)插入片段＜200 bp時(shí),，使用方案A；當(dāng)插入片段≥200 bp時(shí),，使用方案B,。

方案A：適用于插入片段150-200 bp的文庫(kù)（如mRNA打斷方案為94°C，6 min）

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min,。配制80%乙醇。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×,，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，渦旋或吹打混勻，室溫孵育5 min,。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清,。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后,，小心移除上清,。

6. 重復(fù)步驟5，總計(jì)漂洗兩次,。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中,，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）。

8. 將PCR管從磁力架中取出,，加入21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置,，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

方案B：適用于插入片段大于200 bp的文庫(kù)（如mRNA打斷方案為94°C，5 min或85℃,，8 min）

方案B-1：接頭連接產(chǎn)物的純化

1. 準(zhǔn)備工作：將Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇,。

2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻,。

3. 吸取60 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.6×，Beads:DNA=0.6:1）至Adapter Ligation產(chǎn)物中,，渦旋或吹打混勻,，室溫孵育5 min。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清。

5. 保持PCR管始終置于磁力架中,，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重復(fù)步驟5,，總計(jì)漂洗兩次,。

7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開(kāi)蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（不超過(guò)5 min）,。

8. 將PCR管從磁力架中取出,，加入102 μL ddH₂O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻,，室溫靜置5 min,。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移取100 μL上清至新PCR管中,，準(zhǔn)備進(jìn)行雙輪分選,。

【注】：Ligation Enhancer中含有的高濃度PEG會(huì)對(duì)磁珠雙輪分選產(chǎn)生影響,，所以必須經(jīng)過(guò)一輪純化后再進(jìn)行雙輪分選。

方案B-2：雙輪分選

1. 請(qǐng)渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻,。

2. 根據(jù)DNA//片段長(zhǎng)度要求,，參考表10，在上述100 μL DNA中加入*輪分選磁珠,，渦旋或移液器吹打10次混勻,。

表10文庫(kù)分選推薦磁珠比例

【注】：此表推薦的雙輪分選比例適用于AMPure^® XP磁珠和Hieff NGS^® DNA Selection Beads；表中“×”表示樣品DNA體積,。如所需文庫(kù)插入片段主峰為300 bp時(shí),，若在短接頭連接之后分選，樣品DNA體積為100 μL,，則*輪分選磁珠使用體積為0.65×100 μL=65 μL,，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL；若在長(zhǎng)接頭連接之后分選,，樣品DNA體積為100 μL,，則*輪分選磁珠使用體積為0.62×100 μL=62 μL，第二輪分選磁珠使用體積為0.15×100 μL=15 μL,。

3. 室溫孵育5 min,。

4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移上清到干凈的離心管中,，殘留1-2 μL溶液于管底,。

5. 參考表10向上清中加入第二輪分選磁珠。

6. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻,，室溫靜置5 min,。

7. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min）,，小心移除上清,。

8. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠,，室溫孵育30 sec,，小心移除上清。

9. 重復(fù)步驟8,。

10. 保持PCR管始終處于磁力架中,，開(kāi)蓋干燥磁珠至剛剛出現(xiàn)龜裂（約5 min）。

11. 將PCR管從磁力架中取出,，加入21 μL ddH₂O,，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min,。

12. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體,。待溶液澄清后（約5 min），小心轉(zhuǎn)移20 μL上清至干凈管中,。

3.6文庫(kù)擴(kuò)增（Library Amplification）

該步驟將對(duì)純化或長(zhǎng)度分選后的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增富集,。

1. 將表11中的試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用,。

2. 于無(wú)菌PCR管中配制表11所示反應(yīng)體系,。

3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應(yīng)液收集至管底,。
**如果您使用的是barcoded adapter,，俗稱(chēng)長(zhǎng)接頭（大Y接頭），即adapter上帶有barcode的完整接頭,，可用試劑盒中的Primer Mix進(jìn)行擴(kuò)增,；【注】：*如果使用的是無(wú)barcode的接頭，俗稱(chēng)短接頭（小Y接頭）,，請(qǐng)使用短接頭試劑中配備的index primer進(jìn)行擴(kuò)增（Cat#12611,，Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 1; Cat#12612, Hieff NGS^® 96 Single Index Primers Kit for Illumina^®, Set 2。Cat#12613, Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 1; Cat#12614,，Hieff NGS^® 384 Dual Index Primers Kit for Illumina^® , Set 2,。）

4. 將PCR管置于PCR儀中,，設(shè)置表12示反應(yīng)程序，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

表12  PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序

3.7 擴(kuò)增產(chǎn)物磁珠純化或分選（Post Amplification Clean Up/Size Selection）

同3.5步驟中純化操作步驟,。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads（0.9×，Beads:DNA=0.9:1）純化文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物,。

3.8 文庫(kù)質(zhì)量控制

通常情況下,，構(gòu)建好的文庫(kù)可通過(guò)濃度檢測(cè)和長(zhǎng)度分布檢測(cè)來(lái)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，具體請(qǐng)參見(jiàn)注意事項(xiàng)六,。

附錄一：mRNA//片段化

圖2. mRNA不同打斷時(shí)間對(duì)應(yīng)的雙鏈cDNA//片段范圍,。取1 μg Universal Human Reference RNA，經(jīng)mRNA提取試劑盒提取后,，分別以94°C,，6 min、85℃,，8 min和85℃,，5 min處理。打斷后mRNA進(jìn)行雙連cDNA的合成,，經(jīng)過(guò)1.8×磁珠回收后,，通過(guò)Agilent 2100 Bioanalyzer進(jìn)行檢測(cè),。

【注】：本結(jié)果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,，若使用其他來(lái)源的RNA，蕞好優(yōu)化打斷時(shí)間,。

相關(guān)產(chǎn)品

HB190702