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產(chǎn)品描述

Anti-Flag親和純化凝膠（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel）由高質(zhì)量的鼠源IgG2b單克隆抗體與Sepharose 4B gel通過(guò)供價(jià)偶聯(lián)制備,，本產(chǎn)品具有較高的Flag標(biāo)簽融合蛋白加載容量（至少為1.1 mg protein/mL凝膠）,，雜蛋白非特異結(jié)合少,，可用于帶有Flag標(biāo)簽的融合蛋白免疫沉淀（IP）和純化,。

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠）可結(jié)合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein）,，C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）,。

產(chǎn)品性質(zhì)

運(yùn)輸和保存方法

冰袋運(yùn)輸,。未開(kāi)封的產(chǎn)品在-20℃下可穩(wěn)定保存1年,。禁止在不含甘油的溶液中凍存！

注意事項(xiàng)

1. 為了您的安全和健康,，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

2. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

使用方法

一,、制備細(xì)胞裂解液（以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例）

注意：樣品中不能含有顆粒不溶物,，可以用0.22 μm濾膜過(guò)濾或10,000×g離心15 min；如有必要,，可以加入蛋白酶抑制劑,；如樣品太粘稠，可以加入核酸酶處理,。

細(xì)胞密度70-90%,，100 mm培養(yǎng)皿（約106-107細(xì)胞），加入1mL裂解液（50 mM Tris-HCl,，pH 7.4,，150 mM NaCl,，1 mM EDTA，1%Triton X-100）,。推薦加入蛋白酶抑制劑Cocktail（Cat 20123ES）。

1）清洗細(xì)胞

貼壁細(xì)胞：去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基,，用PBS洗2次,，去除PBS，加入裂解液（106-107 cells/mL）,。

     懸浮細(xì)胞：細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中,，420×g離心5 min，去除上清,。用PBS重懸,，420×g離心5 min，重復(fù)1次,，去除上清,，

加入裂解液重懸（106-107 cells/mL）。

2）加入裂解液后,，孵育15-30 min,。

3）離心，12,000×g,，10 min,。【貼壁細(xì)胞離心前先把細(xì)胞刮下來(lái)】

4）收集上清到預(yù)冷的樣品管中,。上清可儲(chǔ)存在-70℃,。

二、應(yīng)用

可以使用層析柱或免疫沉淀（IP）純化目的蛋白,。1-3 mL凝膠層析柱可以純化約100 mL細(xì)胞裂解液,；如樣品體積較小（1-2 mL細(xì)胞裂解液）,，可以使用免疫沉淀（IP）法,；如需處理較大體積細(xì)胞裂解液，推薦使用溶液體系,。

1 層析柱法

1.1 裝柱

1）準(zhǔn)備層析空柱（Cat 20520ES-20526ES）,；用2-3倍柱體積的TBS（50 mM Tris-HCl，pH 7.4,，150 mM NaCl）或其他適合緩沖液洗柱2次,。

2）顛倒混勻Anti-Flag親和純化凝膠，保證凝膠均一,。取1-3 mL凝膠裝柱（純化約100 mL細(xì)胞裂解液）,。

3）用2-3倍柱體積的TBS洗2次,，待液體流盡后，用3倍體積的0.1 M Gly-HCl,，pH 3.5沖洗,，要保證凝膠平面平整。Gly-HCl緩沖液處理時(shí)間不要超過(guò)20 min,。

4）用5倍體積TBS平衡凝膠柱,，直至流出液達(dá)到中性pH。

1.2 純化

1）上樣：在層析柱中加滿蛋白裂解液,，重復(fù)上樣2-3次可以盡可能增加蛋白與凝膠結(jié)合量,。

2）清洗：用10-20倍柱體積的TBS清洗，以去除非特異結(jié)合的蛋白,。

3）洗脫（可選以下2種方法之一）：

A,、酸洗脫：收集管中加入15-25 μL 1 M Tris，pH 8.0,，分別用1 mL 0.1 M Gly-HCl,，pH 3.5洗脫，再重復(fù)5次,。

B,、3×Flag多肽（Cat 20571ES）洗脫：用TBS配制Flag多肽溶液（100 μg/mL）洗脫，分別用1倍柱體積多肽溶液洗脫,，重復(fù)4次,。

1.3 填料再生與保存

1）柱再生：使用后立即再生，用3倍柱體積0.1 M Gly-HCl,，pH3.5清洗,，立即用TBS平衡，直至達(dá)到中性pH.

2）保存：用10倍柱體積TBS（含50%甘油,，0.02%疊氮鈉）清洗,，再加入5 mL該溶液至柱中，保存在2-8℃或-20℃中,。

2 免疫沉淀（IP）

2.1 免疫沉淀（IP）

1）充分重懸Anti-Flag親和純化凝膠,，盡量形成均一的溶液。取40 μL混合液（20 μL gel）至新的離心管中,。

2）5,000-8,200×g離心30 s,，使凝膠沉淀在離心管底部，在加入樣品前,，靜置1-2 min,。去除上清，此時(shí)要小心操作,，避免吸到凝膠,。

3）加入500 μL TBS,，輕輕的重懸Anti-Flag Affinity Gel，10,000 rpm離心30 s,，棄上清,，重復(fù)上述步驟1次。

4）可選步驟,。為去除凝膠中痕量的未結(jié)合抗體,，可加入500 μL 0.1 M glycine HCl，pH 3.5清洗凝膠,，離心去除上清,，加入3倍體積TBS,，輕搖2-3分鐘,，5,000-8,200×g離心30 s，棄上清,，重復(fù)洗滌至上清pH為中性,。Glycine HCl處理時(shí)間切勿超過(guò)20 min。

5）加入200-1000 μL細(xì)胞裂解液,，如有必要,，可用裂解液調(diào)整至終體積1 mL。細(xì)胞裂解液的體積取決于Flag融合蛋白的表達(dá)量,。陽(yáng)性對(duì)照,，需要加入1 mL TBS和4 μL 50 ng/μL Flag-BAP融合蛋白（約200 ng）；陰性對(duì)照,，只要加入1 mL裂解緩沖液即可（不含蛋白）,。

6）4℃緩慢孵育2小時(shí)。如需提高結(jié)合效率,，可延長(zhǎng)至過(guò)夜,。

7）5,000-8,200×g離心30 s，去除上清,。

8）上述沉淀用0.5 mL TBS,，輕搖混勻，5,000-8,200×g離心30 s去盡上清,，重復(fù)3次,。

2.2 Flag融合蛋白洗脫（可選以下3種方法之一）

1）非變性洗脫（3×Flag多肽）

a. 配制3×Flag多肽洗脫液：用0.5 M Tris-HCl溶液，pH 7.5（含1M NaCl）溶解3×Flag多肽,，終濃度為25 μg/μL,。用ddH2O稀釋至5 μg/μL，加入3 μL 5 μg/μL的3×Flag多肽,，加入到100 μL TBS中（終濃度150 ng/μL）,。