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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff® qPCR SYBR Green Mix(實時熒光定量)(High Rox Plus)是2×實時定量PCR擴增的預(yù)混合溶液,。Mix中含有熱啟動Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I,、dNTPs,、Mg2+及High Rox。使用時,，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR,，大大簡化操作過程，降低污染幾率,。

本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實時調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性,。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應(yīng)擴增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系,。

適用機型

Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.

運輸與保存方式

冰袋運輸,。-20℃避光儲存，有效期18個月,。

本品避免反復(fù)凍融,。產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I,，保存或配制反應(yīng)體系時需避免強光照射。

注意事項

1. 解凍后Master Mix可能出現(xiàn)絮狀物質(zhì),，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清,，不影響試劑性能。

2. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES）,，以有效去除RNA樣品中殘留的基因組,。

3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作,。

4.本產(chǎn)品僅作科研用途,！

反應(yīng)體系（推薦冰上配置）

【注】： 使用前務(wù)必充分混勻，避免劇烈震蕩產(chǎn)生過多氣泡,。

a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2μM,，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM之間進行調(diào)整。

b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液,，使用體積不應(yīng)超過qPCR反應(yīng)總體積的1/10,。

c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環(huán)為好,。

d) 反應(yīng)體系：推薦使用20μl或50μl,，以保證目的基因擴增的有效性和重復(fù)性。

e) 體系配制：請于超凈工作臺內(nèi)配制,，并使用無核酸酶殘留的槍頭,、反應(yīng)管；推薦使用帶濾芯的槍頭,。避免交叉污染和氣溶膠污染,。

擴增程序 （兩步法）

擴增程序（三步法）
                                       

【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法,。

a) 預(yù)變性時間：根據(jù)不同模板和引物的具體情況可適當(dāng)縮短至2min,。

b) 退火溫度和時間：請根據(jù)引物和目的基因的長度進行調(diào)整。

c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設(shè)置,，幾種常見儀器的時間設(shè)定如下：

  30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast,；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31sec以上：Applied Biosystems: 7300

34sec以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認(rèn)程序,。

結(jié)果分析

定量實驗至少需要三個生物學(xué)重復(fù),。反應(yīng)結(jié)束后需要確認(rèn)擴增曲線及熔解曲線。

1) 擴增曲線：標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線為S型,。

Ct值落在20-30之間時,，定量分析最準(zhǔn)確；

Ct值小于10,，需要將稀釋模板后,，重新進行實驗,；

Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度,，或者增大反應(yīng)體系的體積，以提高擴增效率,，保證結(jié)果分析的準(zhǔn)確性,；
 Ct值大于35時，檢測結(jié)果無法定量分析基因的表達量,，但可用于定性分析,。

2) 熔解曲線：

熔解曲線單峰，表明反應(yīng)特異性好可以進行定量結(jié)果分析,；若熔解曲線出現(xiàn)雙峰或者多峰,，則不能進行定量分析。

熔解曲線出現(xiàn)雙峰,，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標(biāo)峰是引物二聚體還是非特異性擴增,。

如果是引物二聚體，建議降低引物濃度,，或者重新設(shè)計擴增效率高的引物,。

如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設(shè)計更高特異性的引物,。

引物設(shè)計指南

1. 推薦引物長度25bp左右。擴增產(chǎn)物長度150bp為佳,，可以在100bp-300bp內(nèi)選擇,。

2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳,。

3. 引物堿基分布要均勻,，避免出現(xiàn)連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右,。3’端最后一個堿基最好為G或C,。

4. 引物內(nèi)部或者正反兩條引物間最好避免出現(xiàn)有3個堿基以上的互補序列。

5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對,。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補,。

6. 設(shè)計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析,。

相關(guān)產(chǎn)品

HB211207